神经元的3-D成像和分析感染<em>在体内</em>与<em>弓形虫</em
Summary
使用该协议，我们能够从感染寄生虫弓形虫 ，使可视化和的encysting寄生虫和感染的神经元之间的空间关系分析的小鼠图像160微米厚的脑切片。
Abstract
弓形虫是一种专性细胞内寄生虫具有广泛的宿主范围，包括人类和啮齿类动物。在人类和啮齿类动物， 弓形虫建立在大脑终身持续感染。虽然这种脑部感染是无症状的，在大多数人的免疫功能，在发育中的胎儿或免疫功能低下的个体如获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者，这种偏爱与执着在大脑中可能会导致灾难性的神经系统疾病。因此，很显然，献计弓形虫相互作用是由弓形虫产生的症状的疾病的关键，但我们对中枢神经系统（CNS）和寄生虫的细胞之间的细胞或分子的相互作用的了解甚少。在中枢神经系统的小鼠模型弓形体病已经知道了30多年的神经元中的寄生虫仍然存在的细胞，但信息很少哪些神经元的一部分，通常感染（体细胞，树枝状，轴突），如果菌株之间的这种蜂窝关系变化。在某种程度上，这是缺乏二次成像的难度，从动物整体可视化感染神经元。这些图像通常需要连续切片和组织通过电子显微镜或免疫染色后，激光共聚焦显微镜成像的拼接。通过组合多种技术，这里所描述的方法使得能够使用厚的切片（160微米），以确定和包含包囊图像的完整细胞，允许三维可视化和个人，慢性感染的神经元的分析，而不需要免疫染色，电子显微镜，或连续切片和拼接。使用这种技术，我们可以开始理解寄生虫和感染的神经元之间的蜂窝式关系。
Introduction
该方法的总的目标是要获得高的分辨率，被感染的专性细胞内寄生虫弓形虫单个神经元的三维图像。
弓形体通常被认为是由于其较大的中间宿主范围，包括人类和啮齿类动物中最成功的寄生虫之一。在人类和啮齿类动物，通过污染的食物或水摄入的急性感染后， 弓形虫能够通过从它的快速复制的形式（将速殖子）转化成其慢复制和encysting形式引起的中枢神经系统的持续性感染（在缓殖子）。在免疫活性个体，这种潜中枢神经系统感染被认为是相对无症状的，但在免疫受损的个体，如爱滋病患者或移植者，寄生虫的复发可导致致命弓形虫脑炎1,2。此外，最近的研究公顷已经表明，隐性感染弓形虫会导致行为的变化在啮齿类动物3,4，尽管机制仍不清楚。
令人惊讶的是，尽管这些数据突出了CNS- 弓形虫相互作用的重要性，相对知之甚少这种关系，特别是在细胞和分子水平。研究脑寄生虫互动，甚至简单的方面的能力受到了阻碍部分由TECHNOLOGIC限制。例如，大多数的工作表明神经元的细胞，其中包囊坚持已经完成，电子显微镜（EM）5,6。虽然EM提供高分辨率，这是费时，劳动强度大，而且价格昂贵。免疫荧光（IF）测定法最近已结合使用共聚焦显微镜来确认由EM 7所做的工作。中频测定在技术上易于实施和相对便宜的，但使用这些技术来underst和囊肿和感染的神经元之间的空间关系，需要串行重建，这是耗时的，在技术上困难，并且可能会导致有价值的信息丢失。因此，我们开发了可与中枢神经系统弓形虫病的小鼠模型中使用，并允许我们图像感染的神经元的全部未经EM或免疫组织化学（IHC）的方法。通过开发这样的技术，我们可以开始探索以相对快速和廉价的方式感染细胞和囊肿之间的蜂窝式关系。
我们开发的方法，结合了用于光学结算和成像厚脑切片通过共聚焦显微镜8较新的技术与系统，它标志着已经注射了寄生虫蛋白9,10 体内细胞。在这个系统中，我们感染表达绿色荧光蛋白（GFP）的Cre-报告小鼠仅后的Cre介导的重组11 弓形虫 </em>表达红色荧光蛋白（RFP）和Cre重组酶注入到宿主细胞中的9株。这种组合可以让我们收获了感染小鼠的大脑后，中枢神经系统感染建立后，切成厚脑切片，并迅速查明相关领域的图像通过查找RFP +囊肿。要注意，作为绿色荧光蛋白的宿主细胞中表达完全取决于注射的Cre的寄生虫，而不是在感染，一些将GFP +细胞不含有寄生虫10是很重要的。作为该协议的目的是为了能够将图像的整体感染的神经元，重点是仅在GFP +神经元还含有RFP +囊肿，但该协议也可以用于图像的GFP + / RFP –神经元。
一旦感染脑收获并切片，该切片是由甘油结算呈现透明。部的适当的区域，然后用共焦显微镜，人成像感染的宿主细胞，并在其整体的成囊寄生虫降脂前所未有的可视化。在这里，我们提供了一个完整的协议识别，光学结算和成像感染神经元。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于在感染宿主细胞的细胞变化都与疾病结果在感染细胞内的其他生物如HIV，狂犬病，和衣原体18,19，我们开发出一种技术，使我们研究CNS之间发生亲密互动宿主细胞和弓形虫 。这里介绍的方法实现这一目标，通过使慢性感染神经细胞的有效成像。在此之前的方法的发展，这样的成像是耗时的，昂贵的，或者是不可能的。
现在，我们可以使用这种技术来回答有…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢整个Koshy实验室进行有益的讨论。我们感谢侯佩岑Jansma和亚利桑那州神经科学系的大学征求意见，并与成像帮助。我们也感谢波雷卡实验室使用他们的vibratome的。这项研究是由健康的美国国家研究院（NIH NS065116，AAK）的支持。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
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