Abstract
生きた細胞の文脈におけるタンパク質相互作用の研究は、ローカリゼーション、ダイナミクス、相互作用パートナーに関する重要な情報を生成することができます。この情報は、宿主 - 病原体相互作用の文脈において特に価値がある。多くの病原体タンパク質は、細胞内環境内で宿主免疫系および生存の回避を可能にするような方法で、種々の宿主細胞内で機能する。タグ化または変異タンパク質、またはトランスフェクションまたは形質導入を介して病原体遺伝子の導入を発現する株によるインビボ感染これら病原体タンパク質の宿主細胞間相互作用を研究するために、いくつかのアプローチは、一般的に含め、使用されている。これらのアプローチの各々は、長所と短所がある。私たちは、直接細胞に外因性タンパク質を導入する手段を求めた。エレクトロポレーションは、一般的に細胞に核酸を導入するために使用されるが、生物物理学的根拠は全く同じであるが、それ以上のことはほとんどのタンパク質に適用されていない。標準的なエレクトロポレーターは、哺乳動物細胞への親和性タグ化細菌のエフェクターを導入するために使用した。ヒト上皮及びマウスマクロファージ細胞は、従来の方法により培養剥がし、目的の外来細菌性病原体タンパク質（ 例えば、ネズミチフス菌GTGE）と0.4cmのギャップエレクトロポレーションキュベットに入れた。電気穿孔法（0.3 kVの）および短い（4時間）の回復期間の後、細胞内タンパク質は、蛍光の親和性タグを介してタンパク質を標識し、共焦点顕微鏡によって空間的および時間的分布を調べることにより確認した。エレクトロポレーションしたタンパク質はまた、細胞内の機能的かつ正確な細胞内輸送およびタンパク質 - タンパク質相互作用が可能であることが示された。外因性タンパク質は、細胞の表面上に蓄積する傾向があったが、エレクトロポレーションサンプルは、単独でインキュベーション反応する細胞内エフェクター濃度相対の大きな増加があった。プロトコルはシンプルで、APで行われるのに十分に高速である病原性タンパク質の細胞内標的化および機能を含む、宿主細胞中の病原体タンパク質の高スループット特性評価を可能にarallelファッション。
Introduction
多くのグラム陰性細菌に直接、宿主細胞中に1-5（エフェクターと呼ばれる）病原性関連タンパク質を注入するために特殊な分泌系を使用する。宿主免疫の抑制、細胞骨格の変化、細胞内輸送およびシグナル伝達、転写変化の修正、およびホストプロテアソーム改変6-9：これらのエフェクターを含む広範囲の生物学的機能を有している。いくつかのエフェクターの機能は、しかし、ホスト·ターゲットおよび多くの他の生化学的作用（複数の）決定されていない、知られている。野生型および組換え細菌感染を比較する細胞内エフェクター病原性メカニズムを研究するための有効なアプローチであるが、それは、宿主細胞に個別のエフェクターを導入することが有利であることが多い。したがって、宿主細胞の文脈における細菌エフェクタータンパク質を導入し、特徴づけるための単純な方法が非常に望ましい。
実験的な分析のWiの簡素化単一エフェクターが重要な番目他のエフェクターは、対向または冗長機能を有していてもよいように。この単純化を達成するために、研究者は、以前にウイルス形質導入10、マイクロインジェクション11を含む多くの異なる方法によって細胞内に巨大分子を導入して、12,13のロードこすり、化学的に誘導されマイクロインジェクション14による細胞融合、独自のタンパク質「トランスフェクション」は、試薬15、リン酸カルシウム沈殿16、およびエレクトロポレーション17-20。導入された分子は、タンパク質、細胞不透過性色素、および細胞内ターゲット21,22のための抗体のDNA、RNA、およびRNAiの種を含む核酸の範囲である。いくつかの方法を導入することができる高分子の種類などの制限があり、特に、下流の分析は、高い細胞毒性、作用機序の損傷、低効力、または導入効率に制限されてもよい。トランスフェクション、ofte哺乳動物細胞中で細菌遺伝子を発現させるためのnに使用される方法は、また、マクロファージおよび初代細胞のようないくつかの関連する宿主細胞型は、トランスフェクションに向かって特に耐性であるという制約を受ける。これを超えて、それは、外来DNAの導入の際に生成細菌タンパク質のレベルを制御することは困難である。
多くの研究は、一般的な実験手法として、細菌および哺乳動物細胞の両方への核酸の電気穿孔法を確立した。しかし、生理的条件下で細胞内にタンパク質を送達するための最良の方法に進行中の研究がある。タンパク質のトランスフェクションに関する報告は有望であるが、高価な試薬及び最適化を必要とする。最小限のコストで細胞標的の多種多様な潜在的に有毒な細菌のエフェクターを導入する欲求は、生体内でこれらのタンパク質を研究するための方法として、エレクトロポレーションを検討するために私達を導いた。
タンパク質のエレクトロポレーション23-25 が満たされるまた、電気トランスフェクションまたは電気注射26として知られているelectropermeabilizationを経由して生きている細胞内にタンパク質を導入するHOD、。この技術は、細胞膜に細孔を作成するために高強度の電気パルスを使用する。これらの可逆細孔は、通常、細胞内空間から除外されている巨大分子が細胞を入力することができます。外部電界が除去されると、膜は、細胞は細孔27,28を通過した分子を保持することができ、再シールすることができる。
標準的なエレクトロは一貫マウスマクロファージ様細胞およびヒト上皮細胞の両方に細菌のエフェクターを導入するために本研究で使用した。この方法は、細胞の生存率のかなりの減少と、迅速、効率的、かつ安価である。導入されたタンパク質は、免疫蛍光顕微鏡で可視化または機能的アッセイのために使用することができる。これは同様に、非毒性基準として緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用して実証されている2 サルモネラエフェクタータンパク質、SspH1とGTGE。私たちは、真核宿主細胞における細菌の病原性タンパク質とその機能の研究のためのレパートリーに追加のツールとしてタンパク質のエレクトロポレーションを提案する。
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Protocol
1.事前に準備します
- 37℃の温かい滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。
- 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したイーグル培地（DMEM）および最小必須培地（MEM）の温かいダルベッコ改変、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシン、37℃である。注：これらはそれぞれ、RAWおよびHeLa細胞のために正常な成長メディア（NGM）を表す。
細胞の調製
- NGMで百分の70から90までの集密度にRAW 264.7細胞を増殖させる。
- 加湿95％空気/ 5％CO 2雰囲気中、37℃で細胞を維持する。
- NGMで70から90パーセントの集密度にHeLa細胞を成長させる。
- 加湿95％空気/ 5％CO 2雰囲気中、37℃で細胞を維持する。
- コレクションの前に、滅菌PBSで一度細胞単層を洗う。
- 無菌コニカルチューブにあらかじめコンフルエント細胞を収集する。
- 静かにRAW細胞をこすりPBSでラバーポリスで、繰り返しピペッティングで細胞集合体を分散させる。
- 目視検査は、培養表面から解離を示すまで、0.25％トリプシン溶液を用いてHeLa細胞を切り離します。例えば、T-75フラスコのために2〜3ミリリットルを使用しています。トリプシン溶液は、全体の成長表面を覆っていることを確認するためにそれに応じて音量を調整します。
- NGMは、10％FBSを含有すると解離反応をクエンチした。
- セル集計を分散させるために繰り返しピペット操作で、トリプシンNGMの少なくとも2倍のボリュームを使用してください。
- 軽く4分間900×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
- 滅菌PBSを用いてトリプシン/停止溶液と同じ体積で再懸濁する。
- 血球計数器またはパーティクルカウンターを用いて細胞数を計測する。
- 軽く4分間900×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
- 5.5×10 6×10 6〜6.0個/ mlのためのPBSの十分な音量で再懸濁します。注：例えば、T-75フラスコapproximを生じる。ately 7.5×10 6細胞29。
- エレクトロポレーションまで氷上に細胞懸濁液を保管してください。
エレクトロポレーションのための3.準備
- 氷上で事前チルエレクトロポレーションキュベット（0.4cmのギャップ）。
- エレクトロポレーション装置の電源を入れ、0.3 kVの電圧を設定する。
注：容量と抵抗が私たちのエレクトロ（メーカー10μFと600Ωでのセット）で調整可能な設定はありませんでした。 - NGMで回復プレートを記入し、37℃の加湿95％空気/ 5％CO 2雰囲気中で平衡化
4.エレクトロポレーション
- （50μgの/ ml）を予め冷却したキュベット中の細胞懸濁液の400μlのを置き、キュベットに選択されたタンパク質20μgのを追加します。
- フリックキュベットを穏やかに約10回の細胞を損傷させることなく混合する。注：キュベットも完全に混合するために数回反転させてもよいが、ピペッティングしないとダウンしているかボルテックス細胞の損傷を防ぐために。
- 1.5から1.7ミリ秒0.3 kVのでエレクトロポサンプル。注：これは、この研究のために典型的だった。
- すぐにエレクトロポレーションフリックキュベット後に優しく〜10回を徹底的に混合する。
細胞の5。メッキ
- 回収プレートで配置する直前まで、氷上でエレクトロポレーションした細胞を持つストアキュベット。
- 最下流の分析のために、余分なエフェクタータンパク質を除去するために予め温めたNGMで細胞を1倍洗う。
- 分析のための細胞を除去し、NGM 3-5 mlの一時停止。
- 4分間900×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
- 所望のプレートサイズのNGMの適切な容積に再懸濁（35mmディッシュ用など 2ml）中。
- 下流の分析のための細胞の適切な量を削除します。
- 例1：顕微鏡分析用ガラスボトムディッシュにプレート。
- 例2：プレートINTそのような親和性精製などのタンパク質分析oを細胞培養プラスチック。
- 細胞は、少なくとも4時間、37℃で加湿した95％空気/ 5％CO 2雰囲気中で平衡化プレートに回復させる。
6.顕微鏡分析
6.1）固定/免疫蛍光染色
- 洗浄細胞を4時間の回復期間の後、滅菌PBSで1倍。
- 室温で2分間、100％メタノールで細胞を固定する。完全に細胞（35mmディッシュ用など 2ミリリットル）をカバーするのに十分なメタノールを使用してください。
- 滅菌PBSで洗浄3X。
- 15分間、PBS中0.4％トリトンX-100で細胞を透過性。例えば、直径35mmの板に1ミリリットルを使用しています。
- エピトープおよび標的タンパク質の位置に応じてトリトンX-100の透過及び強度の長さを調整する。注意：最良の結果はしかし、上記の条件は、ほとんどのCで十分であるべきであり、経験的に各ターゲットのために決定する必要がありますytosolicターゲット。
- RTで1時間、PBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。例えば、直径35mmの板に1ミリリットルを使用しています。
- PBSで洗浄3X。
- 4℃で一晩、抗体結合溶液中で一次抗体（PBS中0.1％トリトンX-100および1％BSA）をインキュベート 穏やかに揺らしながら°C。例えば、直径35mmの板に0.5ミリリットルを使用しています。
- 抗体希釈用の製造元の推奨に従ってください。注：200希釈PKN1抗体は1で使用しながら1,000希釈たとえば、ストレプトアビジン結合ペプチドタグ（SBPタグ）抗体は1で使用した。
- PBSで洗浄4X。
- 光から保護し、室温で1時間、抗体結合溶液中で適切な蛍光結合二次抗体と共にインキュベートする。
- 例えば、室温で1時間、アレクサ488またはアレクサ647を使用する。
- アリのためのメーカーの推奨事項に従ってくださいibody希釈。 （ 例えば 、約1：この研究のために1,000）。
- 例えば、必要に応じて他の汚れを追加し、5μM小麦胚芽agglutinnin（WGA）を室温で1時間、製造業者の推奨に従ってアレクサ647またはDAPIにコンジュゲート。
- 例えば、室温で1時間、アレクサ488またはアレクサ647を使用する。
- 画像への準備が整うまで、光から保護し、PBSおよび4℃で店を洗浄5回、。
6.2）共焦点顕微鏡と画像解析
- 63×油浸対物レンズを用いた倒立共焦点顕微鏡での画像サンプル。
- 492から542 nmの間の帯域幅の放射を有するアルゴンレーザーの488nmのラインを使用して画像の緑色チャネル、。
- 640から718 nmの間の帯域幅の放射を、633nmのダイオードレーザーを使用して、画像の赤チャンネル。
- 407から453 nmの間の帯域幅の放射を、405nmのダイオードレーザーを用いて画像青チャンネル。
- Z-スタックは細胞容積の全体をカバーする複数のチャンネルを確認してください。
- 適切な画像処理ソフトウェアで処理·イメージ。
7.アフィニティ精製
- 4時間の回復期間の後、4℃PBSで2回エレクトロポレーションした細胞を洗浄。
- 氷上で溶解緩衝液（PBS中のプロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤1％トリトンX-100）の〜1.0ミリリットルと溶解する。製造業者の指示に従って、阻害剤を使用してください。注：たとえば、両方の本研究で用いたホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤は、100倍で供給したが、他の製剤は、同様に良好に動作するはずです。
- 速やかにラバーポリスで細胞をこすりし、円錐形のチューブに集める。
- 激しいボルテックスおよび超音波処理によって溶解する。注：他の溶解方法は、同様に同様に動作する可能性がありますが、効率は経験的に分析要件の適合性として決定する必要があります。
- 断続的にボルテックスしながら超音波処理3×30秒。
- 収集するために4℃で10分間万×gで遠心分離し細胞破片と不溶性の凝集体。上清を保存します。
- 転倒回転で4℃で一晩ストレプトアビジンアガロース樹脂懸濁液50μlでエレクトロ細胞溶解物の等容量（〜1.0ミリリットル）を組み合わせる。注：この樹脂は、そのストレプトアビジン結合ペプチドの親和性タグを経由して電気穿孔したタンパク質（および関連複合体）をキャプチャします。
- 2分間2500×gで遠心分離し、上清を捨てる。
- 40床体積（〜1ミリリットル）PBSで2回洗浄します。
- 30μlの4X LDSローディングバッファー（141 mMのトリス塩基、2％LDS、10％グリセロール、0.51 mMのEDTA、0.22 mMのSERVAブルーG、赤0.175 mMのフェノール、pH8.5）中、20μLのdiH 2 O、および1μlのを追加します。いくつかのボリュームを可能にする0.5 Mトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）は、ビーズ中に残留する。
- 10分間95℃で加熱し、氷上で冷却する。
- 5分間、4℃で>万XGスピン。
- 上清を収集します。
- 適切な抗体を用いたウエスタンブロットを実行注：彼再度、抗PKN1一次抗体が使用される。
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Representative Results
概念の最初の証明として、精製された緑色蛍光タンパク質が正常にエレクトロポレーションを用いて哺乳動物細胞に導入した。 GFP、おおよそ27 kDの分子量のタンパク質は、一般的に重要な細胞毒性なし分子生物学のツールとして（通常は、プラスミドDNAから発現）哺乳動物細胞に導入される。 HeLa細胞（ 図1A）インキュベートまたは蛍光GFPシグナルをチェックするために、免疫蛍光共焦点顕微鏡続いを25μg/ mlのGFPと（ 図1B）、エレクトロポレーションした。 GFPは、細胞の細胞質ゾルの中にあったことを実証するために、細胞は、核を示すために、サイトゾル境界（赤）、ならびに核酸染色剤、DAPI（青）を描写するコムギ胚芽凝集素（WGA）で染色した。ない細胞内タンパク質は、GFPとインキュベートした細胞では観察されなかった細胞内のGFPシグナルは、唯一のエレクトロポレーションの際に観察された。同様の結果は、RAW264.7マウスで観察されたマクロファージ様細胞（ 図1Cおよび1D）。 WGAは、優先的に、原形質膜中の残基に結合し、従って、インキュベーションの長さに基づいて、点状の染色を示すことができるレクチンであることに留意されたい。 図2Aは、図1（a）よりも長い期間インキュベートした。図1Aおよび図2Aを 、比較してください。
エレクトロポレーションは、その後、タグ付き、精製されたサルモネラエフェクター、GTGEまで延長された。 GTGE、既知の毒性因子30、我々のグループによって発見された宿主細胞31に分泌される、最近システインプロテアーゼ32であることが示された。 HeLa細胞を、50μg/ mlのGTGEとインキュベートまたはエレクトロポレーションした。免疫蛍光分析のために、細胞をGTGE上のストレプトアビジン結合ペプチドの親和性タグに対する抗体で染色した。細胞は、WGAおよびDAPIで染色した。でインキュベートしたHeLa細胞（ ふぃぎゅ）2A再緑色蛍光焦点の欠如により可視化なしの細胞内GTGEはない。対照的に、HeLa細胞（ 図2B）は、エフェクタータンパク質を示す有意な蛍光の細胞内シグナルは、エレクトロポレーションプロセスのために細胞に入った表示電気穿孔した。 RAW細胞は、インキュベーション（ 図2C）中に細胞表面上のタンパク質を蓄積するわずかに増加傾向を示したが、細胞内シグナルは、エレクトロポレーション（ 図2D）上に見られた。
共焦点顕微鏡で細胞内局在を可視化するための検出限界を決定することは、潜在的に有毒な細菌のエフェクターで、細胞の過負荷を回避しながら、十分なタンパク質は、細胞に入ったことを確認することが重要であった。 図3では、GTGEはRAWマクロファージ様2.5、25の細胞、および50μg/ mlの中に電気穿孔した。次いで、細胞を固定し、GTGE上のタグに対する抗体で染色した。 ONLY病巣の非常に小さな数が25μg/ mlの、（ 図3B）での見かけの病巣の増加番号を、2.5 / mlのGTGE（ 図3A）で観察されたが、明確な病巣の最大数は、最大のタンパク質で見られた濃度テストし、50μg/ mlの（ 図3C）。同様の染色パターンは、細胞内タンパク質は、容易に共焦点顕微鏡法によって確認することができ、これらのタンパク質濃度で示すサンプルの間で観察された。を50μg/ mlの上記のタンパク質濃度は、タンパク質の濃度が増加するためのように試験されなかったので、細胞の表面に吸着さになる標的タンパク質の傾向はなかった。膜関連タンパク質のこれらの凝集を回避するために、ウェスタンブロット（ 図6、一番右のレーン）で可視化したタンパク質相互作用に十分なホストを得るために、2つのエレクトロポレーションキュベットをプールすることが必要となった。
さらにINTことを実証するために、roducedタンパク質は単に細胞表面に吸着されなかった、連続した光学切片ごと0.35から0.43マイクロメートル（Z-スタック）共焦点顕微鏡を用いて焦点面で画像化した。 RAW細胞を、50μg/ mlのGTGEで電気穿孔した（ 図4、AおよびB）のように染色した。 Z-スタックはGTGEが細胞内実際にあったことを示したと病巣が細胞（ 図4B、平面36の26）の上部に下部（ 図4A、平面36の6）から延びている。同様の結果は、すべての電気穿孔のタンパク質が得られた。エフェクタータンパク質またはエレクトロポレーションしない対照細胞集団の固有の蛍光プロファイルは、蛍光共焦点顕微鏡によって調べたところ、無視できる程度であることが見出された。
さらに、エレクトロポレーションしたタンパク質は、それがエンドサイトーシス経路を介して分解の標的とされたかどうかを確認するために調べた。細胞は、Ras関連タンパク質5A（Rab5の）について染色した、初期エンドソーム（ 図4C）、またはリソソーム関連膜タンパク質1（LAMP1）、後期エンドソームおよびリソソーム（ 図4D）のためのマーカーのためのマーカー。エレクトロポレーションしたタンパク質と、これらの細胞マーカーの間に共局在は、（エレクトロポレーションし、タンパク質がエンドソーム/リソソームの中にあったIE）、それらの間の密接な物理的相互作用を示すことになる。共焦点顕微鏡は、エレクトロポレーションしたタンパク質（GFPまたはGTGE）がLAMP1またはRab5のと共局在しなかったことを示した。これは、直接細胞内にエンドサイトーシスまたは治療の4時間以内にエンドサイトーシス経路をターゲットにされなかったタンパク質を導入し、このから推測した。
外因性タンパク質の導入は、数時間または数日間にわたって細胞効果を有することができ、それが導入されたタンパク質の持続性を調べることがしばしば有益である。エレクトロポレーションしたタンパク質は、エレクトロポレーション後、分解せずに持続するだろうどのくらいかを決定します。ベースのO接着および細胞拡散のn個の可視化、4時間後にエレクトロポレーションした細胞のおおよその最小回復時間であると決定された。一時的にタンパク質の持続性を観察するためにタイムコース実験は細胞4、24、またはエレクトロポレーション後96時間後に染色を行った。細胞形態は、回復を示唆するとき、4時間（ 図5A）の後、細胞内タンパク質のかなりの量があった。 24時間（ 図5B）の後、細胞内部にかなりのエレクトロポタンパク質は、まだありました。エレクトロポレーション後の時間は、固定および染色（ 図5C）初期治療後のタンパク質の持続日数を実証低下した見かけの豊富さではあるが観察可能な病巣があったが、前に96時間まで延長した場合であっても。
二つの重要な注意点は、これらの実験の過程の間に認められた。 RAW細胞は、細胞表面irreに外来タンパク質を蓄積させるHeLa細胞よりも高い傾向を示したインキュベーションのspective（ 図6A）またはエレクトロポレーション（ 図6B）。それにもかかわらず、すべてのエレクトロポレーションのサンプルは、内部タンパク質（ 図1、図2、図5（b））を増加していた。さらに、膜関連タンパク質は、時間の経過とともに消えた。第二の警告は、小さいからなる表現型を示す細胞の小集団であった両方の制御における外因性タンパク質を大量に負荷された細胞を丸く（インキュベート）と処理した（エレクトロポレーション）細胞（ 図6 C及びDは 、インキュベーションサンプルが示されている）。これらの細胞の核はDAPI染色に基づいて、凝縮クロマチンを示し、アポトーシスを示唆する、細胞容積全体を充填した。これは、（細胞周期または収穫/治療のための通常の一部として生じる）、アポトーシス細胞がバッファからタンパク質を吸収する傾向を有することが可能である。
エレクトロポレーションしたタンパク質が機能したとカレをローカライズできることを実証するために、CTLY宿主細胞の共局在及びサルモネラエフェクタータンパク質SspH1とその既知のホスト·ターゲットとの間のタンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質キナーゼN1（PKN1）の内側33を示した。エレクトロポレーション後、SspH1とPKN1間の物理的相互作用は、ウェスタンブロット（ 図7A）、続いて親和性に基づく免疫沈降により確認した。共局在はまた、フルオロフォアは、空間34に重なるために十分近接していることを示し、共焦点顕微鏡で観察した。 50μg/ mlのSspH1とエレクトロポレーション後、HeLa細胞（ 図7B）を固定し、SspH1（緑）、PKN1（赤色）について染色した。低レーザパワー明確な病巣（黄色）ではSspH1とPKN1を示す核内で観察された相互作用するのに十分な物理的に接近していた。この相互作用は、文献で確立されている。しかしこの研究では、核内に共局在を示した最初のものである。
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図1：GFPのエレクトロ- HeLa細胞またはRAW 264.7細胞を 、細胞を抗GFP抗体（緑）、DAPI核特異的プローブと共にインキュベートしたまたは精製された緑色蛍光タンパク質（GFP）を25μg/ mlのエレクトロポレーションおよび染色した（青色。 ）、およびWGA（赤）細胞質の境界を線引きする。インキュベートした（A）HeLa細胞は、GFPの内在化の欠如を示す緑色蛍光が存在しないことを示す。（B）にエレクトロポGFPの代表的な顕微鏡写真を示す。 GFPが細胞に入ったことを示す細胞病巣の出現に注意してください。（C）及び（D）（C）インキュベートしたRAW細胞の代表的な画像であるか、または精製された緑色蛍光タンパク質を25μg/ mlの（D）にエレクトロポ。
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図2： サルモネラエフェクターGTGEのエレクトロ- サルモネラエフェクターは、GTGE、および抗エフェクタータグ抗体（緑）で染色したタグ付けされたHeLa細胞の細胞親和性を50μg/ mlの（A）または電気穿孔（B）インキュベートし、 DAPI、核マスク（青）、およびWGA（赤）は、細胞質の境界を線引きする。 （A）は、HeLa細胞（C）細胞内にエレクトロポエフェクタータンパク質を示す、電気穿孔GTGEの代表的な顕微鏡写真を示す（B）。GTGEの内在化の欠如を示す緑色蛍光が存在しないことを示し、（D）の代表的な画像であるインキュベートどちらサルモネラ GTGEを50μg/ mlのと同じ方法で、それぞれ、インキュベートまたはエレクトロポレーションしたRAW細胞。水色がWGAから赤色蛍光の組み合わせ、またはオーバーレイ、で二次抗体からの緑色蛍光。
図3：エレクトロポレーションしたタンパク質の滴定- RAWマクロファージ様細胞は 、細胞を2.5μg/ mlの（A）、25μg/ mlの（B）、または50μg/ mlの（C）サルモネラエフェクターGTGEで電気穿孔し、回復させた。 4時間。細胞を固定し、抗SBPタグ抗体（緑色）および核マスク、DAPI（青色）で染色した。タンパク質のより高い出発量を用いた場合、より良好な結果が得られたが、それは、共焦点縮小コピーを経由を2.5μg/ mlの細胞内GTGE示す蛍光病巣を可視化することが可能である。 （簡単に過度の膜結合凝集することなく、共焦点顕微鏡で観察し細胞内タンパク質を含む）満足な結果がGTGEため、nは、50μgの/ mlで得られた。Oより高い濃度を試験した。
図4：タンパク質の内在化およびエンドソームマーカーと共局在の欠如にエレクトロタンパク質が内部であった場合可視化するために、共焦点顕微鏡により得られた連続光学スライス（Z-スタック）。。 RAW細胞を、50μg/ mlのGTGEでエレクトロポレーションした。（A）皿の底上36の光学スライス6、zスタック（2.1マイクロメートル）を示している。（B）同一視野を示しているが、スライス26時36.細胞増殖巣は、タンパク質が本当に細胞内および細胞表面上に凝集していないことを示す細胞全体に延びている。水色、赤色WGA、緑二次抗体、及び青色DAPIの組み合わせである。エンドソーム/リソソーム、Rab5の、（C）またはリソソームマーカー、ランプ1のマーカーと共局在アッセイ
図5：エレクトロポレーション後のタンパク質の持続時間をかけて電気穿孔GTGEの持続性を示す共焦点顕微鏡写真。。 50μg/ mlのGTGEはHeLa細胞にエレクトロポレーションした。その後、細胞を固定し、抗SBPタグ抗体（緑色）および核マスク、DAPI（青色）で染色した。 4時間（A）は、細胞が回復することを可能にする最小時間であると決定されたと予想されるように最大の細胞内タンパク質を示す。細胞内およびセルの両方に24時間（B）および96時間（C）、グリーン病巣、後lular表面は、タンパク質が日初期治療後に低下しないことを示すエフェクターの持続性を示した。このイメージでライトブルー色は青DAPIと緑の抗体染色のオーバーレイです。 
図6：細胞表面タンパク質凝集およびエレクトロ表現 RAWマクロファージ様細胞を、赤（50μg/ mlのGTGEと（A）または電気穿孔（B）インキュベートし、抗SBPタグ抗体（緑）、WGAで染色した）、およびDAPI（青）を持つ。 RAW 264.7およびより少ない程度にHeLa細胞の両方が、細胞の表面上のエフェクターを集約する傾向があった。全てのエレクトロポレーションした細胞内部のタンパク質が増加していることが示された（HeLa細胞は示さず）。黄色の標的タンパク質のWGAから赤のオーバーレイと緑である。 RAW（C）およびHeLa（D）細胞showinG GTGEとのインキュベーション後に変化した表現型（図示）。いくつかの実験では、差動DAPI染色および細胞質の損失は小さい細胞からなる表現型を示した。水色、赤WGA、緑二次抗体、および青DAPIからのオーバーレイです。共焦点顕微鏡は、核内に蓄積し、標的タンパク質を示すために使用された。外因性タンパク質を含んだ細胞のこの表現型はインキュベーションおよびエレクトロポレーションの両方の後に登場しているので、1はアポトーシスを示唆するように、この表現型を仮定することができます。 
図7：。エレクトロポレーションサルモネラ SspH1とホストタンパク質相互作用-ウエスタンブロット（A）に続いて修正されたアフィニティー精製を行う前に、4時間回復させた細胞はSspH1に記載された濃度でエレクトロポレーションしたHeLa細胞 、を濃縮するとセリン/トレオニンプロテインキナーゼN1（PKN1）：既知の真核生物の相互作用パートナーを検出する。 1キュベットからの信号が背景にブレンドし、まだPKN1はまだ無餌コントロールで見られる結合の欠如の上に濃縮したように、右端の車線（2倍EP）は、2プールされたキュベットが含まれていることに注意してください。ウェスタンブロットはPKN1に対するモノクローナル抗体でプローブされる前に、ネイティブのHeLa溶解物、精製SspH1、及びアフィニティー精製試料を用いて実行されました。目標検出は、一次抗体のアイソタイプに対して反応性を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を介して得られた。 HeLa細胞を50μg/ mlのSspH1でエレクトロポレーションした後、共焦点顕微鏡によって経由PKN1（赤）とSspH1（緑）との間の共局在（黄色）を示す（B）。この光学的重なりは、エフェクターと宿主タンパク質が物理的に相互作用するのに十分に近いことを示している。相互作用が最初に核内に示されたという事実は、追加のサポートを提供することタンパク質は、ホストによって正しく人身売買された。
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Discussion
病原性細菌から分泌されたエフェクターは、宿主細胞環境内で機能するように進化してきたので、それは、宿主内で、その場でそれらを研究するために有用である。宿主細胞への関心の特定のエフェクターの導入は、関連する病原体 - 宿主相互作用は、他の細菌タンパク質からの干渉なしに孤立して研究することができるようになります。目標は、それによってトランスフェクションまたは形質導入に関連する課題のいくつかを回避し、真核生物宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質を導入するための手段として、エレクトロポレーションを探索することであった。緑色蛍光タンパク質を対照として使用したサルモネラエフェクタータンパク質を試験した。なぜなら、上皮細胞ならびに免疫細胞、ヒト上皮様細胞株（HeLa細胞）およびマウスマクロファージ様細胞（RAW 264.7）をホスト標的病原菌の関心を使用した。エレクトロポレーションは、細胞viabiliんのかなりの減少に伴って宿主細胞に外因性タンパク質を提供することができますティ、および配信のタンパク質は、最大4日間細胞において検出可能であった。
エレクトロポタンパク質の効果を分離するために、純粋なタンパク質が必要である。本研究では、タンパク質は、 大腸菌で発現させたN末端 ポリヒスチジンおよびストレプトアビジン結合ペプチドタグで大腸菌株 BL21。タンパク質濃度（一般的には5~25の間のmg / ml）であり、純度についてアッセイし、Ni-NTA樹脂で精製し、エレクトロポレーションされるまで-80℃で保存した。商業的に生産されたタンパク質はまた、高純度かつ十分に特徴づけのである傾向があるように、エレクトロポレーションのために許容可能である。
このプロトコルにおける重要なステップは、完全に洗浄して、細胞培養培地を除去し、タンパク質を含まない緩衝液中で細胞を懸濁含ま。これは、観察されたダウンストリームの表現型は、目的の外因性タンパク質にはなく、培養培地中に存在するタンパク質に起因していることを保証する。細胞密度があったときにエレクトロポレーションの効率向上が観察された最良のセル数、セルサイズおよびタイプによって変動するものの、より高い（ 例えば、6×10 6対1×10 6細胞）。実験のもう一つの重要なステップは、細胞が時間が回復し、皿に再接続できるようにすることでした。接着細胞を本研究に使用したので、これは必要であった。それが意図された研究の性質に応じて、適切な細胞内輸送、タンパク質 - タンパク質相互作用、又は酵素活性のためのタンパク質の時間を与えるために必要であり得るが、回復期間は、懸濁細胞にはあまり重要であるべきである。配信のタンパク質が最大96時間、細胞の内部で観察されたので、前に顕微鏡の可視化や細胞アッセイの潜伏期間の調整の余地があります。
このプロトコルのいくつかの変数が異なる細胞型、タンパク質標的、または下流の分析スキームのために最適化されてもよい。エレクトロポレートされるタンパク質の量は、所望の細胞内濃度を微調整することができる。フォータンパク質局在のr個の可視化は、わずか1μgを使用することができる。機能的研究のために、タンパク質のより高い出発量が必要とされ得る。また、電気穿孔後の細胞の回復のための時間の量は、短絡または拡張することができる。不安定なタンパク質標的または高速下流のプロセスは、より短いインキュベーション時間を必要とするであろう。また、播種した細胞の量は、ここで提案を超えて調整することができます。導入されたタンパク質は、顕微鏡検査によりモニター、またはエレクトロポレーションしたタンパク質は、ウェスタンブロットのような用途のために回収される場合に、より密にメッキされる場合、細胞はよりまばらにめっきすることができる。
エレクトロポレーションは、生きた細胞内にタンパク質を導入するためのシンプルで簡単な方法であるが、技術にはいくつかの制限があります。この方法は、マイクログラム量で高純度のタンパク質が必要です。わずか1μgのエレクトロポレーションおよび共焦点顕微鏡で可視化したが、タンパク質のより高い出発量がBett製を与えた。視覚的な結果は、ER。タンパク質の機能は、エレクトロポレーション後の全ての濃度で評価されなかったが、同等以上、50μg/ mlのタンパク質濃度は、ウェスタンブロットのために適切な信号のために必要であった。また、エレクトロポレーションキュベットのサイズの制約のために、スケールアップすることは、細胞の複数のキュベットの処理が必要な場合があります。しかし、細胞が調製されると、電気穿孔法、単なる秒かかることを考慮すると、並列処理が少しの余分な時間と労力を要する。
導入されたタンパク質は、ウェスタンブロット、顕微鏡で観察、またはアフィニティ精製の ために使用される場合、タンパク質は、親和性精製または検出のために利用可能な抗体のタグ35を有するべきである。しかし、未知の理由のために、文献または他の生化学的方法（データは示していない）から知られているいくつかの相互作用は、エレクトロポレーションの後で要約することができなかった。これは、ホストがFとしていくつかのエレクトロポレーションしたタンパク質を認識していることもありoreignかつ迅速プロテアソーム分解のためにそれらをマークします。
エレクトロポレーションは、タンパク質送達のための他の既存の方法に比べていくつかの利点を保持する。マイクロインジェクションに比べて、エレクトロポレーションは、より速く、簡単であり、多数のセルは、試験した条件のために、ほぼ100％の生存率を一度に処理することができる。エレクトロポレーションはまた、市販の試薬を用いたタンパク質のトランスフェクションよりも安価である。 DNAトランスフェクションは、多くの場合、宿主細胞内での細菌のエフェクタータンパク質を研究するために使用される。しかしながら、これは、ホストによって非理想的に合成される細菌タンパク質を生じる。一方、細菌タンパク質のエレクトロポレーションは、エフェクタータンパク質は、細菌によって発現され、感染プロセスのよりよい表現を可能にする、哺乳動物のタンパク質発現機構への依存を除去する。
いくつかのアプリケーションは、細菌ホストインテラの調査方法などのタンパク質エレクトロポレーションを使用することができますctions。まず、多くの場合、トランスフェクトすることが困難である一次細胞は、タンパク質の送達のためのエレクトロポレーションにより適してもよい。これは、より多くの生物学的に関連する細胞型におけるエフェクター機能の研究を可能にする。エレクトロポレーションも多重化タンパク質および/または治療の選択肢を提供します。例えば、複数のタンパク質を同時に導入してもよいし、薬物および他の小分子は、タンパク質と一緒に送達することができる。導入されたタンパク質の効果の機能的な理解を得るために最も重要な、タンパク質のエレクトロポレーションは、細胞内局在を決定するために、アフィニティー精製、タンパク質の機能および相互作用についてのアッセイ、公知の標的、細胞全体の発現解析、及び顕微鏡に対するウェスタンブロットで結合することができる導入されたタンパク質の局在。したがって、この方法は、他の細胞および分子生物学技術と一緒に細菌性病原体の生物学を解明するためのツールとして大きな可能性を秘めている。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
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