JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em> C. ايليجانس</em

Published: January 08, 2015
doi:
10.3791/52321
, , , ,
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research,Northwestern University

Summary

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Abstract

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Introduction

وترتبط العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، الضموري العضلي التصلب الجانبي (ALS)، والاعتلال الإسفنجي المعدية (TSEs)، مع البروتينات المعرضة للتجميع، وبالتالي تعرف باسم البروتين misfolding اضطرابات (تطوير إدارة الأداء ). TSEs أو أمراض بريون تشكل فئة فريدة من تطوير إدارة الأداء في أنها يمكن أن تكون معدية في كل من البشر والحيوانات 1. على المستوى الجزيئي، والبريونات تكرار من خلال تجنيد وتحويل أحادى α-الحلزون الغنية المشفرة المضيف بي ار بي الخلوي (بي ار بي C) في المرضية ورقة β الغنية بي ار بي الشوري التشكل 2،3. وقد تم تحديد المجاميع البروتين نشر النفس أيضا في الفطريات، التي تشترك في الخصائص المهمة مع البريونات الثدييات 4،5. بالإضافة إلى ذلك، والبريونات الثدييات قادرة على الانتقال من خلية الى خلية وتصيب خلايا ساذجة 6،7.

في حين تطوير إدارة الأداء الغيرإيه من TSEs ليست معدية، إلا أنهما يشتركان مبدأ المسببة للأمراض مشتركة مع الأمراض بريون 8،9. على الرغم من أن البروتينات ترتبط كل من تطوير إدارة الأداء لا ترتبط في هيكل أو وظيفة، وأنهم جميعا المجاميع شكل من خلال عملية تشبه بلورة تسمى منوى أو المصنفة البلمرة. وعلاوة على ذلك البذور البروتينية تنمو من خلال تجنيد الإسوية القابلة للذوبان على 2،10،11. كفاءة لنشر الذاتي تختلف في الجسم الحي، وهذا يتوقف على الخصائص الجوهرية للبروتين، والتي جنبا إلى جنب مع العوامل الخلوية إضافية مثل المحرمين الجزيئي تحدد في نهاية المطاف معدلات التنوي الكلي، البذر، والتجزؤ ونشر 12-15. وبالتالي، يجب ان يكون هناك توازن دقيق بين هذه العوامل التي تسمح نشر كفاءة من البروتين التجميع. قد يفسر هذا أيضا لماذا فقط بعض المجاميع amyloidogenic تؤوي خصائص بريون، وبالتالي ليس كل تطوير إدارة الأداء والمعدية. ويبدو أن البريونات لتمثيل س 'أعلى فناني الأداءاتحاد كرة القدم طيف واسع من المجاميع البروتينية الذاتي تكرار، مما يجعلها أداة قوية لدراسة تطوير إدارة الأداء 8،13.

يثير الاهتمام والفضول، وسمية المرتبطة المجاميع المرتبطة المرض غالبا ما يكون غير خلية عنصر مستقل 16،17. وهذا يعني أنها تؤثر على الخلايا المجاورة التي لا تعبر عن الجين المقابل، على النقيض من تأثير مستقل الخلية بدقة، مما يعني أن فقط الخلايا معربا عن المعرض الجين النمط الظاهري محدد. وقد تجلى ذلك بشكل مقنع عن طريق التعبير الأنسجة محددة أو هدم البروتينات منها في نماذج عديدة من أمراض الاعصاب 18-26. وقد اقترحت آليات مختلفة كأساس لهذه الخلايا غير سمية الحكم الذاتي في تطوير إدارة الأداء، بما في ذلك إمدادات تقلص المواد الغذائية، وخلل في الإشارات العصبية، الغلوتامات التحفيز الزائدة، وneuroinflammation 16،27،28. وبالإضافة إلى ذلك، migh حركة تشبه بريون من المجاميع المرتبطة المرض بين الخلايار المساهمة في هذا الجانب 29،30. وتشير أدلة متزايدة على أن الادراج البروتين أخرى من البريونات يمكن أن تنقل من خلية الى خلية، وهو ما قد يفسر نشر سمة من الأمراض التي لوحظت في العديد تطوير إدارة الأداء 30-36. ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد ما إذا كانت هناك علاقة سببية واضحة بين الحركة بين الخلايا البروتينات المرض وتأثير سام على الخلايا المجاورة. ولذلك، فهم أفضل للمسارات الخلوية التي تكمن وراء انتقال خلية الى خلية خلية وغير سمية الحكم الذاتي أمر ضروري وأساسي لتطوير علاجات جديدة. ومع ذلك، لا يفهم كثير من جوانب بريون مثل نشر والخلوية العوامل التي تؤثر على انتقال الخلية الى خلية من البروتينات تتجمع في metazoans جيدا، ولا سيما على مستوى العضوي.

الديدان الخيطية ايليجانس انواع معينة لديها العديد من المزايا التي توفر إمكانات ل اكتشاف جوانب جديدة من تشبه بريون SPREADIنانوغرام في metazoans 17. انها شفافة، والسماح لفي الجسم الحي تتبع البروتينات من الموسومة fluorescently في الكائن الحي. وعلاوة على ذلك، يتم الحفاظ العديد من العمليات الخلوية والفسيولوجية المتضررين من المرض من الديدان إلى الإنسان، وC. ايليجانس هي أيضا قابلة للطائفة واسعة من التلاعب الجيني والتحليلات الجزيئية والكيمياء الحيوية 37-39. بالضبط 959 الخلايا الجسدية تشكل خنثى الكبار مع خطة الهيئة البسيطة التي لا يزال لديها العديد من أنواع الأنسجة متميزة، بما في ذلك العضلات، والخلايا العصبية والأمعاء.

لوضع نموذج جديد في بريون C. ايليجانس، اخترنا للتعبير عن خارجيا وتتميز كذلك الجلوتامين / الأسباراجين (Q / N) الغنية بريون NM المجال من عصاري خلوي بروتين بريون Sup35 الخميرة، حيث لا توجد بروتينات بريون الذاتية المعروفة في الديدان 4،40. وقد البريونات الخميرة لا تقدر بثمن في توضيح الآليات الأساسية لتكرار بريون 41-44. وعلاوة على ذلك، NM هو التنوبالحادي وعصاري خلوي البروتين مثل بريون التي قد تظهر لتلخيص دورة الحياة الكاملة للبريون في الثقافة خلايا الثدييات 45،46. وبالمثل، عندما أعرب في C. ايليجانس، المجال بريون Sup35 اعتمدت بشكل جيد لمتطلبات مختلفة للنشر في الخلايا metazoan بالمقارنة مع خلايا الخميرة والملامح الرئيسية عرضت من بريون البيولوجيا ارتبط 40. NM التجميع مع النمط الظاهري السامة العميق، بما في ذلك تعطيل سلامة الميتوكوندريا ومظهر من مختلف الحويصلات الالتهام الذاتي ذات الصلة على المستوى الخلوي، فضلا عن اعتقال الجنينية واليرقات، تأخر في النمو، واضطراب واسع النطاق للبيئة طي البروتين على المستوى العضوي. لافت للنظر، يسلك المجال بريون خلية مستقلة وغير خلية سمية مستقلة، مما يؤثر على الأنسجة المجاورة التي لم أعرب التحوير. وعلاوة على ذلك، يتم مراقبة النقل حويصلي في مجال بريون داخل وبين خلايا في الوقت الحقيقي <em> في الجسم الحي 40.

نحن هنا وصف كيفية فحص نشر مثل بريون في C. ايليجانس. سوف نشرح كيفية مراقبة النقل داخل الأقاليم وفيما بين الخلايا من الحويصلات التي تحتوي على المجال بريون باستخدام الوقت الفاصل بين مضان المجهري. سوف نؤكد على أن استخدام أجهزة الاستشعار الأنسجة محددة قابلة للطي وأعرب بتواجد مطلق للصحفيين الإجهاد لتقييم آثار خلية خلية مستقلة تتمتع بالحكم الذاتي وغير على اللياقة البدنية الخلوية. وأخيرا، فإننا سوف تصف الإجراء من الجينوم واسعة تدخل الحمض النووي الريبي (رني) شاشة أجريت مؤخرا لتحديد معدلات جديدة من سمية التي يسببها بريون. في الجمع، ويمكن لهذه الأساليب تساعد على ندف بصرف النظر مسارات الجينية التي تساهم في الحركة بين الخلايا البروتينات وغير خلية سميتها مستقلة.

Protocol

1. رصد العابر للنشر من البروتينات مثل بريون بواسطة فيفو في الوقت الفاصل بين التصوير ملاحظة: تنمو C. ايليجانس البرية من نوع (WT) (N2) وخطوط المعدلة وراثيا وفقا للأساليب القياسية ومراقبة بعناية درجة حرارة زراعة 47. <ol style="…

Representative Results

مراقبة بيخلوي نشر من البروتينات مثل بريون من قبل في الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير المعدلة وراثيا C. خطوط ايليجانس معربا عن المجال بريون بشكل خاص مناسبة تماما لتحليل جوانب معينة من مثل بريون البروتين?…

Discussion

الأساليب المذكورة هنا تساعد على توضيح نشر والخلية معقدة المستقلة وغير المستقلة سمية الخلايا من البروتينات مثل بريون. اكتشفنا مؤخرا أن يؤخذ على عصاري خلوي مجال بريون المعرضة للتجميع ما يصل إلى الحويصلات بغشاء في عملية الالتهام الذاتي ذات الصلة. مجموعة فرعية معينة من…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Materials

Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding ‘one-dimensional crystallization’ of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer’s disease and scrapie. Cell. 73 (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2 (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75 (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79 (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington’s disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Biol Chem. 274 (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286 (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123 (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442 (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179 (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7 (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22 (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302 (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46 (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22 (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16 (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45 (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97 (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209 (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33 (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11 (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch’ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12 (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9 (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate ‘protein-only’ inheritance in yeast. Nature. 400 (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482 (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6 (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  50. Shaham, S. Methods in cell biology. Wormbooks. , (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14 (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5 (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16 (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5 (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. n. a. K. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12 (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31 (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8 (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5 (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283 (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71 (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. , (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).

Tags

Keywords: PrionPrion-like ProteinProtein AggregationProteostasisCaenorhabditis ElegansPrion DomainSup35Fluorescent TagGenetic ApproachesPrion PropagationCell-to-cell SpreadingProtein Misfolding DiseasesAlzheimer’s DiseaseParkinson’s DiseaseALSTransmissible Spongiform Encephalopathies
check_url/kr/52321?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image