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생물학

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em> C. elegans</em

Published: January 08, 2015
doi:
10.3791/52321
, , , ,
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research,Northwestern University

Summary

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Abstract

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Introduction

Muitas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), e encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), estão associados a proteínas de agregação propensas e são, portanto, conhecidos coletivamente como proteína misfolding transtornos (EPM ). EET ou doenças provocadas por priões constituem uma classe única de EPM em que eles podem ser infecciosas em seres humanos e animais 1. A nível molecular, prions replicar recrutando e convertendo monomérica α-hélice-rico codificado-host PrP celular (PrP C) para o patológico β-folha-rico conformação PrP Sc 2,3. Agregados de proteína auto-propagação também foram identificados em fungos, que partilham características importantes de mamíferos com priões 4,5. Além disso, os priões mamíferos são capazes de mover a partir de célula-a-célula e infectar células naive 6,7.

Enquanto EPM other do TSE não são infecciosos, eles compartilham um princípio patogênico comum com doenças de príon 8,9. Embora as proteínas ligadas a cada um dos EPM não estão relacionados em termos de estrutura ou função, eles todos formam agregados por meio de um processo de cristalização, chamado nucleada ou semeada de polimerização; Além disso sementes proteicos crescer através do recrutamento de suas isoformas solúveis 2,10,11. A eficiência para a auto-propagam in vivo varia, dependendo das propriedades intrínsecas da proteína, que, em conjunto com factores celulares adicionais, tais como as chaperonas moleculares, em última análise determinam as taxas de nucleação agregado, a sementeira, a fragmentação e espalhamento 12-15. Por isso, deve haver um bom equilíbrio entre esses fatores que permite a propagação eficiente de agregação de proteínas. Isso também pode explicar por que apenas alguns agregados amiloidogénicas abrigar as características de um prião, e, assim, nem todos os EPM são infecciosas. Os príons parecem representar o 'top-performers'fa amplo espectro de agregados proteicos de auto-replicação, o que os torna uma ferramenta poderosa para estudar EPM 8,13.

Curiosamente, a toxicidade associada com agregados relacionados com a doença muitas vezes tem um componente autônomo não célula 16,17. Isto significa que eles afectam as células vizinhas que não expressam o gene correspondente, em contraste com um efeito estritamente autónoma célula, o que implica que apenas as células que expressam o gene exibem o fenótipo específico. Este foi convincentemente demonstrada pela expressão específica de tecido ou derrubar das respectivas proteínas em vários modelos de doenças neurodegenerativas 18-26. Vários mecanismos têm sido sugeridos como uma base para esta não-toxicidade celular autônomo na EPM, incluindo o fornecimento de nutrientes diminuído, o desequilíbrio na sinalização neuronal, excitotoxicidade do glutamato, e neuroinflammation 16,27,28. Além disso, um movimento de prião semelhante de agregados ligados de doenças entre as células might contribuir para este aspecto 29,30. Uma evidência crescente sugere que outras inclusões de proteína que pode transmitir priões a partir de célula-para-célula, o que pode explicar a característica de difusão na patologia observada em muitos EPM 30-36. No entanto, ele ainda não foi determinado se há um claro nexo de causalidade entre o movimento intercelular de proteínas doença eo efeito tóxico sobre as células vizinhas. Por conseguinte, um melhor entendimento das vias celulares que estão subjacentes a transmissão célula-a-célula e célula não autónomo toxicidade é necessária e essencial para o desenvolvimento de novas terapias. No entanto, muitos aspectos do prião como espalhando-celulares e factores que influenciam a transmissão célula a célula de proteínas mal enroladas em metazoários não são bem compreendidos, em particular ao nível dos organismos.

O nemátodo Caenorhabditis elegans tem várias vantagens que oferecem o potencial de descobrir novas facetas de spreadi prion-likeng em metazoans 17. É transparente, permitindo a rastrear in vivo de proteínas marcadas fluorescentemente no organismo vivo. Além disso, muitos processos celulares e fisiológicas afectadas pela doença são conservados de vermes para a saúde humana, e C. elegans é também susceptível a uma grande variedade de manipulações genéticas e análises moleculares e bioquímicos 37-39. Exatamente 959 células somáticas compõem o hermafrodita adulto com um plano corporal simples, que ainda tem vários tipos de tecidos diferentes, incluindo músculos, neurônios e intestino.

Para estabelecer um novo modelo de príon em C. elegans, que escolheu para expressar exogenamente a glutamina bem caracterizada / asparagina (Q / N) rico em prião NM domínio do cytosolic proteína de levedura prion Sup35, já que não há proteínas príon endógenas conhecidas em vermes 4,40. Prions levedura foram inestimáveis ​​para elucidar os mecanismos básicos de prion replicação 41-44. Além disso, NM é o abetoproteína prião como citosólica-r que tem sido mostrado para recapitular o ciclo de vida completo de um prião em cultura de células de mamífero 45,46. Da mesma forma, quando expresso em C. elegans, o domínio prion Sup35 adotado muito bem com as diferentes necessidades para propagação em células metazoários em comparação com células de levedura e principais características expostas da biologia prion agregação 40. NM foi associada com um fenótipo tóxico profunda, incluindo a ruptura da integridade mitocondrial e aparecimento de várias vesículas autofagia relacionados sobre o nível celular, bem como prisão embrionário e larval, atraso do desenvolvimento, e uma perturbação generalizada do ambiente dobramento de proteínas ao nível do organismo. Surpreendentemente, o domínio príon celular apresenta toxicidade autônoma e não autônomos celular, afetando tecidos vizinhos em que o transgene não foi expressa. Além disso, o transporte vesicular do domínio prião dentro e entre as células é monitorado em tempo real <em> in vivo 40.

Aqui nós descrevemos como examinar divulgação prion-like em C. elegans. Vamos explicar como monitorar o transporte intra e intercelular de vesículas contendo o domínio prion usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Vamos enfatizar o uso de sensores de dobradura de tecidos específicos e universalmente expressa repórteres de estresse para avaliar Cell efeitos autônomos autónomos e não sobre fitness celular. Finalmente, vamos descrever o procedimento de uma grande tela recentemente realizada genoma RNA de interferência (RNAi) para identificar novos modificadores de toxicidade induzida por prion. Em conjunto, estes métodos podem ajudar a provocar uma separação de caminhos genéticos envolvidos no movimento intercelular de proteínas e sua toxicidade autónoma non celular.

Protocol

1. Monitoramento transcelular Espalhando de proteínas príon-like por In Vivo tempo-lapso NOTA: Crescer C. elegans do tipo selvagem (WT) (N2) e linhas transgénicas de acordo com métodos padrão e controlar cuidadosamente a temperatura de cultivo 47. Gerar linhagens transgênicas de C. elegans que expressa a proteína prion-like, marcado com proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP). Assista a este vídeo que demonstra como usar a m…

Representative Results

Monitoramento intercelular difusão de proteínas príon-like in vivo por time-lapse imaging Transgênicos C. linhas elegans que expressam o domínio prião são particularmente bem adaptados para a análise de certos aspectos de proteínas priões do tipo, por exemplo, transmissão de célula para célula e a toxicidade celular não autónomo. A transparência dos animais permite o acompanhamento de fluorescente etiquetado proteínas de d…

Discussion

Os métodos descritos aqui ajudam a ilustrar espalhando e celular toxicidade autônoma da célula complexo autônomo e não de proteínas príon-like. Descobrimos recentemente que um domínio de prion cytosolic agregação propensas é retomado em vesículas ligadas à membrana em um processo de autofagia relacionados. Um subconjunto específico dessas vesículas transporta o domínio de prião dentro e entre as células e tecidos 40. A chave para controlar o seu movimento no animal vivo é que a proteína te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Materials

Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains
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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).
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