Summary

גישת Bioreporter תא כל להערכת תחבורה וזמינות ביולוגית של מזהמים אורגניים במערכות לא רוויים מים

Published: December 24, 2014
doi:

Summary

Assay bioreporter התא שלם עם sartisoli Burkholderia RP037-mChe פותח כדי לזהות שברים של מזהמים אורגניים (כלומר, fluorene) זמינים לשפלת חיידקים לאחר תחבורה פעילה על ידי mycelia גישור נקבוביות אוויר מלא במערכת מודל בלתי רוויה מים.

Abstract

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

Introduction

אדמה מאוכלסת בצפיפות על ידי מגוון רחב של מיקרואורגניזמים 1,2 כגון חיידקים. עם זאת, תנאים בבית גידול זה הם מאתגרים, במיוחד במונחים של מים זמינות 3. חיידקים זקוקים באופן קבוע כדי לחפש תנאים אופטימליים בסביבות הטרוגניות 4, אבל היעדר סרטי מים רציפים וכתוצאה מכך הניידות הוגבלה 5 מעכב אותם כדי להפיץ באופן חופשי. כמו כן, שיעורי דיפוזיה של מומסים (למשל, חומרים מזינים) הם הורידו בתנאים בלתי רוויים 6. לפיכך, חיידקים וחומרים מזינים לעתים קרובות מופרדים פיזי ונגישות תזונתית מוגבלת 3. כתוצאה מכך, וקטור תחבורה לתרכובות כימיות שאינו דורש מים שלב רציף יכול לעזור להתגבר על מגבלות אלה. למעשה, מיקרואורגניזמים רבים כגון פטריות וoomycetes פיתחו צורת צמיחת פילמנטיות מאפשרת להם לגדול דרך נקבובי אוויר מלא ובכך להגיע וmobilizing גם פיזי מופרד חומרים מזינים 7 ו -8 חומרי פחמני על פני מרחקים ארוכים. הם עשויים אפילו לשמש כוקטורי תחבורה ביולוגיים אשר מספקים סוכרים ומקורות אנרגיה אחרים לחיידקי 9. ספיגה והובלה ביצורים mycelial גם הוכחו למזהמים אורגניים הידרופובי כגון פחמימנים ארומטיים polycyclic (PAH) בPythium ultimum 10 או בפטריות mycorrhizal arbuscular 11. מאז PAH הם מזהמי מים נמצאים בכל מקום ומסיסים היטב 12 באדמה, תחבורה בתיווך mycelia עשויה לסייע להגביר את הזמינות הביולוגית מזהם לdegraders חיידקים פוטנציאלי. למרות שהסכום הכולל של מזהם ניתן לכמת באופן ישיר על ידי אמצעים כימיים 10, הזמינות הביולוגית של מזהמים מועברים על ידי mycelia לחיידקי מפרקים ואורגניזמים אחרים לא ניתן להעריך בקלות.

הפרוטוקול הבא מציג שיטה להערכת ההשפעה של myceליה על זמינות ביולוגית מזהם לdegraders חיידקים באופן ישיר; הוא מאפשר איסוף מידע על השפעת spatiotemporal של מזהמים על מערכות אקולוגיות של חיידקים. אנו מתארים כיצד להגדיר את מערכת מיקרוקוסמוס בלתי רוויה משוכללת מחקה ממשקי אוויר-מים בקרקע על ידי קישור מקור נקודת PAH מופרד פיזי עם חיידקי bioreporter PAH-משפיל באמצעות וקטורי תחבורת mycelial. בגלל תחבורה מוטסת מודרה, את ההשפעה של תחבורה מבוססת mycelial על זמינות ביולוגית PAH לחיידקים ניתן ללמוד בדרך מבודדת. בפירוט רב יותר, RP037-mChe sartisoli fluorene שלוש טבעות PAH, האורגניזם mycelial Pythium ultimum וbioreporter חיידק Burkholderia 13 יושמו בsetups מיקרוקוסמוס תאר. B. החיידק sartisoli RP037-mChe נבנה במקור כדי ללמוד והנתיבים phenanthrene לתא 14 ומביע משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) כתוצאה משטף PAH להתא, ואילו fluorescing האדום mCherry בא לידי ביטוי constitutively. מידע מפורט על בניית הכתב ניתן על ידי Tecon et al. 13 בבדיקות ראשוניות, עולה כי אין החיידק שחייה ורק יכולת רץ איטית מאוד. זה היה יכול להעביר לאט בעובש של ultimum Pythium כאשר מיושמים כהשעיה צפופה על גבי העובש. מאז חיידקים היו משובצים בagarose בפרוטוקול הבא, הגירה על העובש לא התרחשה.

באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר (CLSM), ניתן דמיינו חיידקי bioreporter ישירות במיקרוקוסמוס וביטוי של eGFP ניתן לכמת ביחס לכמות תאים (הפרופורציונלית לאות mCherry) בעזרת ImageJ התוכנה. זה מאפשר השוואת זמינות ביולוגית איכותית בתרחישים שונים (כלומר, גבוה או נמוך יותר). שפעת נמצאה זמין ביולוגי לאחר תחבורת mycelial על ידי פ ' ultimum (כלומר, זההיה גבוה יותר מאשר בבקרה שלילית). יתר על כן, הפרוטוקול מתאר כיצד לכמת את הסכום הכולל של תחבורה בתיווך mycelia באמצעים כימיים וכדי לוודא את הזמינות הביולוגית מזהם באמצעות סיבים מצופים סיליקון זכוכית (סיבי SPME) במיקרוקוסמוס הזהה. תוצאות באמצעות התקנת מיקרוקוסמוס זה פורסמו ונדונו לשילוב של פ ultimum, fluorene ו- B. sartisoli 15 RP037-mChe. כאן, במוקד נמצא על תיאור מפורט ושיטת זיהוי בעיות הפוטנציאליות של הפרוטוקול כדי לספק את הידע הזה ליישומים נוספים פוטנציאליים. יישומים נוספים עשויים להיות כרוכים בפטריות שונות, מיני חיידקים (למשל, מאתרים מזוהמים), ומזהמים אחרים (למשל, חומרי הדברה) או זיהום אספקה ​​(למשל, קרקעות בגיל).

Protocol

1. הכנת מנות, צ'יימברס שקופיות והדגירה הכן את החומר הבא לכל מיקרוקוסמוס: פלסטיק אחד גדול תחתון פטרי צלחת (ד = 10 סנטימטרים), אחד שונה (ראה שלב 1.2) פלסטיק קטן תחתון פטרי צלחת (d = 5 סנטימטרים) עם מכסים והחלק תא ספירה אחת עם שלו…

Representative Results

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 15. נא עיין במאמר לדיון מכניסטית וסביבתי מפורט. לאחר הקלטת תמונה באמצעות CLSM, הקרנת עוצמה מקסימלית ניתן לבצע באמצעות תוכנת מיקרוסקופ המתאימה או ImageJ כדי לקבל רושם ראשוני חזותי של המדגם וק…

Discussion

התקנת מיקרוקוסמוס הציגה הוכיחה מתאימה ללמוד את הזמינות הביולוגית של כימיקלים מופרדים מרחבית למשפילה אורגניזמים לאחר הספיגה והובלה בmycelia. תחבורת גז שלב פוטנציאלית של תרכובות נדיפות באופן חלקי מנוע ויכול להיות דמיינו תאי bioreporter חיידקים ללא הכנת מדגם משוכללת ובכך עם ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest
  Solution 1
    Ammonium sulfate  Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
    Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
    Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
  Solution 2
    Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
    Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
  Solution 3 pH 6.0
    Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
    Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
    Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
    Manganese(II) chloride x 1 H2O        Carl Roth   4320.2 10 mg L-1
    Copper(II) sulfate Carl Roth  P023.1 1 mg L-1
    Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth  0274.1 3 mg L-1
    Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
    Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
    Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
    Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
    Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
    Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
    Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2 %
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8
    Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
    Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK  1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
    Yeast extract Merck 1037530500
    Tryptone Serva 4864702
    Sodium chloride Carl Roth 3957.1
imageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).

Play Video

Cite This Article
Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

View Video