Summary

A Whole Hücre Bioreporter Yaklaşımı Su Doymamış Sistemleri Organik Kontaminantların Taşıma ve Biyoyararlanımını Değerlendirmek için

Published: December 24, 2014
doi:

Summary

Burkholderia sartisoli RP037-mChe ile bir bütün hücre bioreporter deney, bir su doymamış model sisteminde hava dolu gözenekler köprü misel aktif taşıma sonra bakteriyel indirgenmesi için uygun bir organik kirlilik (örneğin, floren) fraksiyonları tespit etmek için geliştirilmiştir.

Abstract

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

Introduction

Toprak yoğun bakteri gibi mikroorganizmalar 1,2 geniş bir yelpazede ile doldurulur. Ancak, bu yaşam koşulları, özellikle su durumu 3 açısından, zorlu. Bakteriler kalıcı heterojen ortamlarda 4 optimal koşulları aramak gerekir, ancak sürekli su filmlerin olmaması özgürce yaymak için onları engelleyen kısıtlı hareket 5 sonuçlanıyor. Ayrıca, çözünenlerin difüzyon hızları (örneğin, besinler) doymamış koşullarda 6 altında indirilir. Böylece, bakteri ve besin genellikle fiziksel ayrılır ve besin erişilebilirlik 3 sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, sürekli bir su-fazı gerektirmez kimyasal bileşikler için bir taşıma vektörü, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Aslında, bu tür mantar ve Oomycetes kadar mikroorganizmalar bu şekilde ulaşmak ve mobi hava dolu gözenekli boşluklar sayesinde büyümesini sağlayarak lifli bir büyüme formu geliştirdiklizing fiziksel uzun mesafelerde besin 7 ve 8 karbonlu maddeler ayrılır. Hatta bakteri 9 şekerler ve diğer enerji kaynakları sağlar biyolojik taşıma vektörü olarak hareket edebilir. Alım ve mantar organizmalarda taşıma aynı zamanda, Pythium ultimum 10 veya arbusküler mikoriza mantar 11 polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH), hidrofobik organik kirletici maddeler için gösterilmiştir. PAH her yerde ve suda az çözünen kirleticiler toprakta 12 olduğundan, Miseller-aracılı taşıma potansiyeli bakteriyel degraders için kirletici biyo artırmaya yardımcı olabilir. Kirletici taşıma miktarı kimyasal doğrudan ölçülebilir Oysa aşağılayıcı bakteri ve diğer organizmalar için misel tarafından taşınan kirleticilerin biyolojik kolaylıkla değerlendirilebilir edilemez, 10 anlamına gelir.

Aşağıdaki protokol myce etkisini değerlendirmek için bir yöntem sunardoğrudan bir şekilde bakteri degraders için kirletici biyo üzerinde lia; mikrobiyal ekosistemler üzerindeki kirleticilerin zamanmekansal etkisi hakkında bilgi toplama sağlar. Biz nasıl misel ulaşım vektörler aracılığıyla PAH-aşağılayıcı bioreporter bakteri ile bir fiziksel ayrılmış PAH noktası kaynağını bağlayarak toprakta hava-su arabirimleri taklit ayrıntılı bir doymamış evren sistemini kurmak açıklar. Havadaki ulaşım hariç Çünkü, bakteriler için PAH biyoyararlanım üzerine misel-temelli ulaşım etkisi izole bir şekilde ele alınabilir. Daha ayrıntılı olarak, üç halka PAH fluoren, misel organizma Pythium ultimum ve bioreporter bakteri Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 tarif evren kurulumları uygulanmıştır. bakteri B. sartisoli RP037-mChe başlangıçta hücre 14'e fenantren akıları çalışma yapılmıştır ve PAH akımının bir sonucu olarak, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş ifade ederMCherry kurucu olarak ifade edilen kırmızı flüoresan oluşturan ise hücre. Muhabir inşaat ile ilgili detaylı bilgiler Tecon et al., Ön testlerde 13 ile verilir, bakteri yok yüzme ve sadece çok yavaş kaynaşma yeteneği ortaya çıkardı. Bu hif üzerine yoğun bir süspansiyon halinde tatbik edildiği zaman Phytium ultimum hif yavaş yavaş göç edebildi. Bakteriler aşağıdaki protokol agaroz gömülü olduğundan, hif üzerinde göç meydana gelmedi.

Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, bioreporter bakteri mikrokosmlarından doğrudan görülebilir ve eGFP sentezlenmesi yazılım ImageJ yardımıyla (MCherry sinyale orantılı), hücrelerin miktarı ile ilgili olarak tayin edilebilir. Bu farklı senaryolarda niteliksel biyo karşılaştırarak izin verir (yani, daha yüksek veya daha düşük). GRİP P. misel nakliyeden sonra bio-yararlı olduğu bulunmuştur ultimum'a (yani, onu), negatif kontrol olarak daha yüksektir. Ayrıca, protokol kimyasal yollarla Miseller-aracılı taşıma miktarını ölçmek için ve aynı mikrokosmlarından silikon kaplı cam elyaf (SPME lifler) ile kirletici biyo doğrulamak açıklamaktadır. Bu evren kurulumu kullanarak sonuçları yayınlandı ve P. kombinasyonu için tartışılmıştır ultimum, fluoren ve B sartisoli RP037-mChe 15. Burada, odak potansiyeli daha uygulamalar için bu bilgiyi sağlamak için detaylı bir yöntem açıklama ve protokol potansiyel tuzaklar belirlenmesi yatıyor. Diğer uygulamalar (kontamine sitelerden örneğin,) çeşitli mantar, bakteri türlerini içerir ve diğer kirleticiler (örn, böcek ilaçları) veya kirletici kaynağı (örneğin, yaşlı topraklar) olabilir.

Protocol

Yemekleri, Slaytlar ve Kuluçka Odaları 1. Hazırlık Her mikrokozmos için aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: bir büyük plastik Petri kabı alt (d = 10 cm), modifiye edilmiş bir (adım 1.2) kapaklı küçük plastik Petri kabı alt (d = 5 sm) ve üç oyuğa sahip bir sayım bölmesi slayt. Petri kabı alt parça istenilen sayıda (d = 5 sm) alın. Tam bir slayt (26 mm kenar uzunluğu) uygun bir testere ile ağzına kısmını çıkarın. Sistemi sterilize etmek için,% 70 etanol O / N Petri…

Representative Results

Burada sunulan sonuçlar daha önceki 15 yayınlanmıştır. Ayrıntılı mekanik ve çevresel tartışma maddeye bakınız. CLSM üzerinden görüntü kaydı sonra, maksimum yoğunluk projeksiyon numunenin ilk görsel izlenim ve kontrolleri (Şekil 2) kazanmak için, ilgili mikroskop yazılımı veya ImageJ kullanılarak yapılabilir. Daha sonra, veri setleri belirli görselleştirme yazılımı tarafından anlamlı özelliklerini göstermek için farklı tahmin …

Discussion

sunulan evren kurulum misel tarafından alımı ve ulaşım sonra organizmaların aşağılayıcı mekansal ayrılmış kimyasalların biyolojik çalışma uygun kanıtladı. Kısmen uçucu bileşiklerin potansiyel gaz-faz taşıma önlenir ve bakteriyel bioreporter hücrelerinin hassas sistemin minimum rahatsızlık ile böylece ayrıntılı numune hazırlama olmadan görsel ve edilebilmektedir. Aynı zamanda, numunenin kimyasal analizi, kolay bir elde edilen sonuçların iyi kontrolü için, toplam taşıma ölçümü…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest
  Solution 1
    Ammonium sulfate  Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
    Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
    Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
  Solution 2
    Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
    Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
  Solution 3 pH 6.0
    Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
    Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
    Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
    Manganese(II) chloride x 1 H2O        Carl Roth   4320.2 10 mg L-1
    Copper(II) sulfate Carl Roth  P023.1 1 mg L-1
    Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth  0274.1 3 mg L-1
    Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
    Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
    Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
    Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
    Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
    Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
    Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2 %
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8
    Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
    Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK  1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
    Yeast extract Merck 1037530500
    Tryptone Serva 4864702
    Sodium chloride Carl Roth 3957.1
imageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).

Play Video

Cite This Article
Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

View Video