الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات
Summary
Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.
Abstract
مزيج من التصحيح تسجيلات المشبك من اثنين (أو أكثر) الخلايا العصبية إلى جانب synaptically (تسجيلات تقرن) في الحادة الاستعدادات شريحة الدماغ مع الخلايا في وقت واحد biocytin ملء يسمح تحليل مترابطة من الخصائص الهيكلية والوظيفية. مع هذا الأسلوب أنه من الممكن تحديد وتوصيف كل من الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي من قبل التشكل ونمط استجابة الكهربية. التسجيلات يقترن تسمح بدراسة أنماط الاتصال بين هذه الخلايا العصبية فضلا عن خصائص كل من انتقال متشابك الكيميائية والكهربائية. هنا، نقدم وصفا خطوة بخطوة الإجراءات المطلوبة للحصول على تسجيلات يقترن موثوقة جنبا إلى جنب مع الانتعاش الأمثل للمورفولوجيا الخلايا العصبية. سنقوم بشرح كيف يتم تحديد أزواج من الخلايا العصبية المتصلة عبر نقاط الاشتباك العصبي الكيميائي أو تقاطعات الفجوة في الأعمال التحضيرية شريحة الدماغ. وسوف يحدد كيفية إعادة بناء الخلايا العصبية للحصول على التشكل 3D من dendritويتم تحديد جيم ونطاق محور عصبي وكيف الاتصالات متشابك والمترجمة. وسوف نناقش أيضا المحاذير والقيود المفروضة على تقنيات التسجيل المقترنة، ولا سيما تلك المرتبطة truncations شجيري ومحور عصبي أثناء إعداد شرائح الدماغ لأن هذه تؤثر بقوة التقديرات الاتصال. ومع ذلك، ونظرا للتنوع النهج تسجيل يقترن ذلك ستبقى أداة قيمة في تشخيص جوانب مختلفة من انتقال متشابك في تحديد رقائق الخلايا العصبية في الدماغ.
Introduction
رقائق العصبية بين الخلايا العصبية إلى جانب اثنين من synaptically هي لبنات بناء شبكات واسعة النطاق في الدماغ وهي الوحدات الأساسية لمعالجة المعلومات متشابك. ومن الشروط الأساسية لتوصيف هذه رقائق الخلايا العصبية هو معرفة مورفولوجيا والخصائص الفنية لكل من الخلايا العصبية شريك قبل وبعد المشبكي، ونوع من الاتصال متشابك (ق) وهيكلها وآلية وظيفية. ومع ذلك، في العديد من الدراسات من الاتصالات متشابك واحد على الأقل من الخلايا العصبية في المتناهية الصغر لا يتميز أيضا. هذه النتائج من بروتوكولات التحفيز غير محددة نسبيا غالبا ما تستخدم في دراسات الاتصال متشابك. لذلك، يتم إما لم تحدد الخصائص الهيكلية والوظيفية للعصبون قبل المشبكي على الإطلاق، أو فقط إلى حد صغير إلى حد ما (أي، والتعبير عن البروتينات علامة الخ). التسجيلات يقترن في تركيبة مع تلطيخ الخلايا بواسطة علامات الصورةاوك وbiocytin، neurobiotin أو الأصباغ الفلورية هي أكثر ملاءمة لدراسة رقائق الخلايا العصبية الصغيرة. هذا الأسلوب يسمح احد لتحقيق العديد من المعلمات الهيكلية والوظيفية للاتصال متشابك تحديدها شكليا في نفس الوقت.
وقد تم التحقيق في ما يسمى وصلات الأحادي المشبك "وحدوية" بين الخلايا العصبية في كل مناطق الدماغ القشرية وتحت القشرية 1-10 باستخدام الاستعدادات شريحة الحادة. في البداية، استخدمت الميكروية حادة في هذه التجارب. في وقت لاحق، كان يعمل تسجيل المشبك التصحيح من أجل الحصول على تسجيلات لإشارات متشابك مع انخفاض مستوى الضجيج وتحسين القرار الزماني.
وكان التقدم التقني الكبير في استخدام الأشعة تحت الحمراء على النقيض تدخل الفرق (IR-DIC) البصريات 11-14، وهي تقنية المجهرية التي تحسن كبير في وضوح وتحديد الخلايا العصبية في الدماغ شريحة بحيث أصبح من الممكن رس الحصول على تسجيلات من التعرف بصريا الاتصالات المشبكية 15-17. بشكل عام، وتتم التسجيلات يقترن في الأعمال التحضيرية شريحة الحادة؛ فقط عدد قليل جدا من المنشورات تسجيلات التقارير المتاحة من الخلايا العصبية مرتبطة synaptically في الجسم الحي 18-20.
أهم ميزة من التسجيلات يقترن هو حقيقة أن توصيف وظيفي يمكن جنبا إلى جنب مع التحليل الصرفي في كل من الضوء والإلكترون المستوى المجهري (انظر على سبيل المثال، 7،16،21). بعد المعالجة النسيجية، وتتبع مورفولوجية شجيري ومحور عصبي من الزوج الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. وفي وقت لاحق، فمن الممكن لتحديد معالم شكلية مثل الطول، الكثافة المكانية، والتوجه، المتفرعة نمط الخ ويمكن لهذه المعلمات ثم توفر أساسا لتصنيف موضوعي للاتصال متشابك محدد. وعلاوة على ذلك، على النقيض من معظم التقنيات الأخرى المستخدمة لدراسة connecti العصبيةvity، وإرفاقها التسجيلات يسمح أيضا تحديد من الاتصالات المشبكية للاتصالات متشابك وحدوية. ويمكن القيام بذلك مباشرة باستخدام مزيج من الضوء والمجهر الإلكتروني 16،21-27 أو باستخدام التصوير الكالسيوم 28،29 من العمود الفقري شجيري. ومع ذلك، مع النهج الأخير مثير فقط ولكن لا اتصالات المثبطة يمكن دراستها لأنه يتطلب تدفق الكالسيوم عن طريق القنوات مستقبلات بعد المشبكي.
بالإضافة إلى تحليل مفصل للانتقال متشابك في المتناهية الصغر يقترن التسجيلات العصبية يعرف أيضا السماح دراسة قواعد اللدونة متشابك 30،31 أو – في تركيبة مع تطبيق ناهض / خصم – التشكيل من انتقال متشابك من قبل الناقلات العصبية مثل أستيل 32 و الأدينوزين 33.
Protocol
Representative Results
Discussion
التسجيلات تقرن من جانب مثير synaptically و / أو الخلايا العصبية المثبطة هي أسلوب شديد التنوع لدراسة رقائق الخلايا العصبية. لا يقتصر هذا النهج يسمح احد لتقدير اتصال متشابك بين أنواع الخلايا العصبية ولكنه يسمح أيضا تحديد الخصائص الوظيفية لاتصال والتشكل من الخلايا العصبية ق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2-3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
References
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. 신경과학. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. . Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D., Fellin, T., Halassa, M. . Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. 67, 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single ‘barrel’ of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
