JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

Published: January 10, 2015
doi:
10.3791/52358
, ,
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2),Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA,RWTH Aachen University

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

同時細胞内ビオシチン充填急性脳スライス標本における2つ（またはそれ以上）のシナプス結合したニューロン（対の録音）からのパッチクランプ記録の組み合わせは、それらの構造的および機能的特性の相関分析を可能にする。この方法では、その形態および電気生理学的応答パターンの両方によって前およびシナプス後ニューロンを同定し、特徴付けることが可能である。対になった記録は、これらのニューロン間の接続パターン並びに化学的および電気的シナプス伝達の両方の性質を研究することができます。ここでは、ニューロンの形態の最適な回復とともに信頼性の高いペアの録音を得るために必要な手順のステップバイステップの説明を与える。私たちは、化学シナプスまたはギャップ結合を介して接続されたニューロンのペアは、脳スライス標本で識別されている方法を説明します。私たちは、ニューロンがdendritの彼らの3D形態を得るために再構築されているかを概説しますICと軸索ドメインとどのようにシナプスの連絡先が特定され、ローカライズされています。これらは強く接続性の推定値に影響を与えるので、我々はまた、特に、脳スライスの準備中に、樹状および軸索切断をに関連するものを対に記録技術の注意事項と制限事項について説明します。しかし、対になった記録アプローチの汎用性のそれは、脳内で識別ニューロンのマイクロ回路でシナプス伝達のさまざまな側面を特徴付ける貴重なツールのままになります。

Introduction

2シナプス結合されたニューロン間の神経マイクロ回路は、脳内の大規模ネットワークの構築ブロックでシナプス情報処理の基本単位である。そのようなニューロンのマイクロ回路の特徴付けのための前提条件は、前およびシナプス後パートナーニューロンの両方の形態学的および機能的特性を知ることがシナプス結合（単数または複数）およびその構造的および機能的メカニズムのタイプである。しかし、シナプス結合の多くの研究で、超小型回路内のニューロンのうちの少なくとも一方は、十分に特徴付けされていない。これは多くの場合、シナプスの接続性の研究に使用される比較的非特異的刺激プロトコルに起因する。したがって、シナプス前ニューロンの構造的および機能的特性のいずれかのすべてまたは唯一のかなり小さい程度に識別されていない（ すなわち、マーカータンパク質の発現など ）。マーカーSによって細胞内染色との組み合わせでペアの録音ビオシチン、neurobiotinまたは蛍光染料などのuchが小さなニューロンのマイクロ回路を研究するために適しています。この技術は、一方が、同時に、形態学的に同定されたシナプス結合の多くの構造的および機能的パラメータを調査することを可能にする。

2つのニューロン間のいわゆる「単一の」単シナプス接続は、急性スライス標本を使用して両方の皮質及び皮質下の脳領域1-10に研究されてきた。最初に、鋭い微小電極は、これらの実験で使用した。以降、パッチクランプ記録は、より低い騒音レベルと改善された時間分解能でのシナプス信号の記録を得るために使用した。

重要な技術的進歩は、赤外線微分干渉コントラスト（IR-DIC）光学11-14、かなりことができるトンとなるように脳切片におけるニューロンの視認性及び識別を改善顕微鏡技術を使用することであったO視認シナプス結合15-17からの記録を入手。一般的には、対になった記録は、急性スライス標本で行われている。ごく少数の出版物は、生体 18-20 でシナプス接続ニューロンからの録音を報告可能です。

対になった録音の最も重要な利点は、機能的特徴は、光および電子顕微鏡レベルの両方で、形態素解析と組み合わせることができるという事実である（ 例えば、参照、7,16,21）。組織化学的処理の後、シナプス接続ニューロンペアの樹状突起と軸索形態がトレースされます。続いて、これらのパラメータは、特定のシナプス結合の目的の分類のための基礎を提供することができる等の長さ、空間密度、配向、分岐パターンとして形態学的特徴を定量化することが可能である。さらに、神経connectiを研究するために使用されるほとんどの他の技術とは対照的にVITY、対になった録音は、また単一のシナプス結合のためのシナプスの連絡先の識別を可能とする。これは、光学および電子顕微鏡16,21-27の組み合わせを使用して、または樹状突起棘のカルシウムイメージング28,29を用いて直接行うことができる。それがシナプス後受容体チャネルを介してカルシウム流入を必要とするが、後者のアプローチのみではなく、興奮抑制結合を研究することができる。

アゴニスト/アンタゴニストのアプリケーションと組み合わせて- -対に定義されたニューロンのマイクロ回路におけるシナプス伝達の詳細な分析に加えて、記録はまた、シナプス可塑性ルール30,31または研究を可能にするようなアセチルコリン32およびアデノシンなどの神経伝達物質によるシナプス伝達の調節を33。

Protocol

全ての実験手順は、動物の保護、​​ドイツの動物保護法のためのEU指令（Tierschutzgesetz）と欧州実験動物学協会連合会のガイドラインに従って実施されてきた。 電気生理学1.セットアップペアリング記録を開始する前に、電気生理学のセットアップを構築する必要があります。このようなセットアップが組み立てられるかを簡単な概要は以下のとおり?…

Representative Results

対になった記録は、形態学的に同定されたユニまたは双方向のシナプス結合の詳細な特徴付けのための選択の方法、ならびにギャップジャンクション（電気的）接続（ 図1）である。体性感覚バレル皮質の層4における対の記録の例を図1Aに示されている。一方向性の興奮性および抑制性シナプス接続の両方が（ 図1B、C）特徴づけることができる。さらに?…

Discussion

シナプス結合された興奮性および/または抑制性ニューロンからの対応のある記録は、神経マイクロ回路の研究のための非常に汎用的なアプローチである。だけでなく、このアプローチは、一つのニューロン型の間のシナプス接続を推定することを可能にするだけでなく、接続および前およびシナプス後ニューロンの形態の機能的特性を決定することができない。さらに、アゴニストおよび/?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2-3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
  2. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
  3. Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
  4. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  5. Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
  6. Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. 신경과학. 54 (2), 329-346 (1993).
  7. Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
  8. Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
  9. Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  10. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
  11. MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
  12. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  13. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  14. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
  15. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  16. Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
  17. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
  18. Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
  19. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
  21. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
  22. Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
  23. Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
  24. Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
  25. Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
  26. Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
  27. Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
  28. Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
  29. Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
  30. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
  31. Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
  32. Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
  33. Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. . Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
  34. Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D., Fellin, T., Halassa, M. . Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. 67, 405-431 (2012).
  35. Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single ‘barrel’ of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
  36. Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
  37. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  38. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
  39. Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
  40. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
  41. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  42. Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
  43. Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
  44. Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
  45. Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
  46. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  47. Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
  48. Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
  49. Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
  50. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
  51. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  52. Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
  53. Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
  54. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
  55. Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
  56. Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
  57. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).

Tags

Keywords: Paired Patch-clamp RecordingAcute Brain SliceNeuronal MicrocircuitsSynaptic TransmissionElectrophysiologyMorphologyConnectivityChemical SynapsesGap JunctionsNeuron ReconstructionDendritic TruncationAxonal Truncation
check_url/kr/52358?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image