がん薬感の有効性を評価<em>インビトロ</em>と<em>インビボ</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
による異質と同じ経路を標的ヒト癌、単剤療法、または併用レジメンに固有の変異のハイレベルに、失敗する可能性がある。重点は、治療への内因性および/または適応耐性に関与している経路の阻害の際に配置する必要があります。研究の活発な分野での作用を促進するDNA修復阻害剤の開発および試験され、そして、一般的に使用される化学療法および放射線療法に対する耐性を防ぐ。我々はDNA損傷薬剤シスプラチンに対して腫瘍細胞を感作するための手段としてBRCA2阻害の有効性を評価するための新規なプロトコルを使用する。腫瘍細胞の代謝（酸性および呼吸）分毎分で治療効果を描写するために72時間にわたりリアルタイムでモニターした。組み合わせでは、血管外遊出および浸潤のニワトリ胚漿尿膜（CAM）モデルを使用して、転移頻度の評価を行った。このプロトコルは、一般的に、新規な癌治療レジメンを評価するために、インビトロおよびインビボの方法を使用するの短所のいくつかに対処する。これは、より密接に候補標的及び薬剤間を区別し、さらなる発展のためには、最も有望な候補を選択するために、そのような細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、およびin vivoのマウス異種移植研究におけるような一般的な方法に加えて使用することができる。
Introduction
標的および/ または細胞傷害性癌治療に対する獲得 耐性は治療の失敗、再発、および増加した患者の死亡率1をもたらすことができる重要な臨床的問題である。ほとんどの腫瘍における不均一性の高いレベルを考えると、十分に高い細胞数の腫瘍は、それらの細胞は生存のために2,3依存している分子経路を標的とする単一または併用療法に耐性の細胞のサブセットを含むこと数学的確実性である。このような腫瘍細胞は積極的疾患の再発につながる、治療中に選択することができる。同時に治療媒介選択の前または後のいずれかで、異なる癌細胞の生存メカニズムを標的とする新規治療法の開発は、このように臨床的に重要である。
腫瘍ゲノムにおけるゲノム不安定性および突然変異の高レベルは、非腫瘍宿主細胞4から癌細胞を区別する基本的な特性である。その結果、usefuDNA損傷化学療法の有効性を高め、抵抗性の発達を防止するために、Lの戦略は、積極的に腫瘍細胞5にDNA修復を阻害することである。これは、調査のアクティブなフィールドであり、新規なDNA修復対象の様々な前臨床設定において探索されている。これらの標的の小分子またはアンチセンスベースの阻害剤が開発されているとテスト6-8を受けている。目的は、最も有望な前臨床候補を特定し、臨床試験におけるそれらの安全性および有効性を評価することである。
臨床試験のコストが高く、（次善の前臨床評価を含む様々な理由のために）失敗のリスクは、新しい治療法9の開発に進行する手ごわい障害となっている。十分新しい治療標的および候補薬物を評価するための適切な厳密な前臨床モデルの使用は、臨床試験の10の高い故障率を減少させることができる</suP>。
新規な抗癌療法の有効性を評価するためのいくつかの一般的に使用される前臨床の方法がある： インビトロ （細胞増殖アッセイ） 腫瘍細胞増殖を減少させる能力は、a）測定に対する腫瘍細胞の能力のa、b）療法誘発性の減少フォームの組織培養コロニー（コロニー形成アッセイ） インビトロ （レドックス染料変換） における腫瘍細胞の代謝活性におけるc）治療誘発性の減少、関連するインビトロの腫瘍細胞死（アポトーシス、壊死、オートファジーのd）の治療によって誘導される誘導インビボにおける有糸分裂等）11、及びe）ヒトおよびマウス異種移植片12-14の成長またはアブレーションの減少を治療によって誘発される。
記載されているインビトロの方法の主な弱点は、それらのどれも、候補治療法の効果の連続リアルタイム評価を提供しないことである。むしろ、それらは、選択された、広く分離された時点での情報を提供治療の過程。このような測定は、正確に腫瘍細胞応答の大きさおよびタイミングを反映する能力が減少している。 インビボのマウス異種移植モデルは、高コスト、完了するまでの時間の長さは、サブ最適な投与および治療 のタイミング（スケジューリング）の危険性によって制限される。また、齧歯類異種移植モデルは、候補治療的介入への一次ヒト腫瘍細胞および樹立されたヒト腫瘍細胞株の応答15,16 のインビトロ評価に比べて、ヒトにおける臨床的有効性の限られた予測因子であるという証拠がある。
我々は、上記の一般的な手順の弱点に対処するようにして、前臨床の新しい薬物の組み合わせを評価するための新規な組合せのプロトコルを考案した。増殖、コロニー形成、またはレドックス色素変換アッセイの代わりに、我々は、リアルタイムで、細胞接着、呼吸、および酸性化を分析するために、代謝測定部を利用全体治療期間17の間に。同時に、我々は、浸潤および転移18,19のニワトリ胚漿尿膜（CAM）モデルを用いてインビボでの治療の組み合わせの効果を調べた。我々は、一般的に使用される化学療法剤シスプラチンの有効性を増強するBRCA2を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の能力を評価するためにこれらの方法を使用する。
Protocol
Representative Results
Discussion
による臨床試験に関連する固有のコストとリスクを、十分に新規の抗癌治療レジメンを評価するために、より良く、より厳密な前臨床試験の方法論を開発する必要がある。現在一般的に使用される技術は、潜在的に有望な治療標的/薬剤とを識別する能力を制限し、あまり効果的であり得るものがあり、すべての展示弱点。我々は、従来の方法の欠点の多くに対処する新規な抗癌アプローチを…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、優秀オンタリオセンターとオンタリオ研究基金からJKへの補助金によって可能となった。
私たちは、撮影時の技術支援のためSiddika Pardhanとピーター·ファーガソンに感謝したいと思います。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
