Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em> İn Vitro</em> Ve<em> İn Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
Nedeniyle heterojenite ve aynı yolu hedef insan kanserlerinin, tek ajan tedavileri, ya da kombinasyon rejimlerinde doğasında mutasyonların yüksek düzeyde, başarısız olma ihtimali vardır. Terapi için, doğuştan ve / veya edinilmiş direnç için sorumlu olan yollarının engellenmesi üzerine yerleştirilmelidir. Soruşturmanın aktif saha geliştirme ve yaygın olarak kemoterapi ve radyoterapi kullanılan, eylem teşvik ve direnç önlemek DNA onarım inhibitörlerinin test ediyor. Biz DNA hasar ilaç sisplatin tümör hücrelerini duyarlı bir araç olarak BRCA2 inhibisyonu etkinliğini değerlendirmek için yeni bir protokol kullanılır. Tümör hücrelerinin metabolizma (asitlenme ve solunum) dakika bazında bir dakika tedavi etkinliğini tanımlamak için 72 saat süreyle gerçek zamanlı olarak izlendi. Birlikte, bir tavuk embriyo koryoallantoik membran (CAM) ekstravazasyon ve işgali modeli kullanılarak metastatik frekansta bir değerlendirme yapılır. BuProtokol yeni kanser tedavi rejimleri değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlerinde kullanılan yaygın bir zayıf bazı problemlere yanıt vermektedir. Bu tür hücre çoğalma tahlilleri, hücre ölümü deneyleri gibi ortak yöntemlere ek olarak kullanılabilir ve in vivo murin ksenograft çalışmaları, daha yakından Aday hedeflerin ve maddeler arasında ayırım yapmak ve daha da geliştirilmesi için, sadece en ümit verici adaylar seçmek için kullanılır.
Introduction
Sitotoksik kanser tedavisi tedavisi başarısızlığı, nüks yol açabilir önemli bir klinik sorundur hedeflenen ve / veya karşı direnç kazanmış ve hasta mortalite 1 arttı. En tümörlerde farklılığının yüksek düzeyi dikkate alındığında, yeterince yüksek hücre sayısının bir tümör bu hücrelerin hayatta kalma 2,3 için bağlı olduğu moleküler yolları hedef tek veya kombine tedavilere dirençli hücrelerin bir alt kümesini içerecek bir matematiksel kesinlik. Bu tümör hücreleri pozitif olarak hastalığın tekrarlama yol, tedavi sırasında için seçilebilir. Aynı anda önce veya tedavi aracılı seçimden sonra ya farklı kanser hücresi hayatta kalma mekanizmalarını hedef yeni tedavilerin geliştirilmesi, böylece klinik açıdan önemlidir.
Tümör genomları genom istikrarsızlık ve mutasyon yüksek düzeyde olmayan tümör konakçı hücrelerden 4 kanser hücrelerini ayıran temel özelliktir. Sonuç olarak, bir usefuDNA hasar, kemoterapinin etkisini arttırmak ve direnç gelişmesini önlemek için l stratejisi aktif tümör hücreleri 5 DNA onarımını inhibe edilmesidir. Bu, bir ön-klinik ortamda araştırılmaktadır soruşturma ve yeni DNA tamir hedeflerin çeşitli aktif bir alandır. Küçük molekül ya da bu hedeflerin antisens bazlı inhibitörlerin bazıları geliştirildi ve 6-8 test geçmektedir. objektif klinik çalışmalarda kendi güvenliğini ve etkinliğini en umut verici klinik öncesi adayları belirlemek ve değerlendirmektir.
Klinik çalışmalarda yüksek maliyeti ve (sub-optimal klinik öncesi değerlendirme de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle için) başarısızlık riski, yeni tedavilerin 9 gelişiminde ilerleme zorlu engeller vardır. yeterince tedavi hedefleri ve aday ilaçlar yeni değerlendirmek için uygun ve klinik öncesi titiz modellerin kullanımı klinik çalışmalarda 10 yüksek başarısızlık oranı düşebilir </sus>.
In vitro (hücre çoğalma tahlilleri), tümör hücrelerinin kapasitesi için, b) terapiyle-uyarılmış azalma, tümör hücre proliferasyonunu azaltmak için kapasite) ölçüm Bazı yaygın olarak kullanılan, klinik öncesi yöntem yeni anti-kanser rejimleri etkinliğini değerlendirmek üzere bir şekilde doku kültürü koloniler (koloni oluşum analizleri), in vitro (redoks-boya dönüşüm), in vitro tümör hücre ölümü, d) terapiyle-uyarılmış indüksiyonu (apoptoz, nekrotik, otofajik ilişkili olarak tümör hücresi, metabolik etkinlikteki c) terapiyle-uyarılmış indirgeme in vivo olarak, mitoz ve diğerleri) 11 ve e) insan ve fare ksenograftları 12-14 büyümesi ya da ablasyon azalma tedavisi kaynaklı.
Listelenen in vitro yöntemlerin önemli bir zayıflığı bunların hiçbiri aday tedavilerinin etkisi sürekli gerçek zamanlı değerlendirme sağlamak olduğunu. Daha ziyade, sadece seçilen, yaygın olarak ayrılmış zaman noktalarında bilgiTedavi sırasında. Bu ölçümler, kesin olarak, tümör hücre yanıtlarının büyüklüğünü ve zamanlamasını yansıtma kapasitesinin azalmıştır. İn vivo fare ksenograft modelleri aynı zamanda yüksek maliyet tamamlamak için zaman süresi ve alt-optimal dozaj ve tedavi zamanlaması (zamanlama) riski ile sınırlıdır. Buna ek olarak, kemirgen ksenograft modelleri primer insan tümör hücrelerinin yanıtların in vitro olarak değerlendirilmesi ile karşılaştırıldığında insanlarda klinik etkinliği sınırlı belirleyicileri ve aday terapötik müdahalelerin 15,16 belirlenen insan tümör hücre hatları olduğuna dair kanıtlar vardır.
Biz yukarıda listelenen daha yaygın prosedürlerin zayıf yönlerini ele alan bir şekilde, ön-klinik yeni ilaç kombinasyonları değerlendirmek için yeni bir kombinasyon protokolü tasarladı. Çoğalma, koloni oluşumu, veya redoks-boya dönüştürme deneylerinde yerine, gerçek zamanlı olarak, hücre yapışmasını, solunum ve asitleştirmeyi analiz etmek için bir metabolizma ölçüm birimini kullanılanTüm tedavi dönemi boyunca 17. Aynı zamanda, bir tavuk embriyo istilası ve metastaz 18,19 koriyoallantoik membran (CAM) modeli kullanılarak in vivo tedavi kombinasyonunun etkileri araştırıldı. Bu yaygın olarak kullanılan kemoterapötik ilaç sisplatin etkinliğini güçlendirmek için BRCA2 hedefleyen bir antisens oligonükleotid (ASO) yeteneğinin değerlendirilmesi için bu yöntemleri kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nedeniyle klinik deneylerle ilgili doğal maliyet ve risk, daha iyi ve uygun yeni anti-kanser tedavi rejimleri değerlendirmek için klinik öncesi test yöntemine daha sıkı geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Güncel sık kullanılan teknikler daha az etkili olabilir tüm sergi potansiyel umut verici tedavi hedefleri / ajanlar arasında ayrım kapasitelerini sınırlandırabilir zayıflıklar, ve bu. Biz geleneksel yöntemlerin eksiklikleri birçok adresleri yeni anti-kanser yaklaşımları değerlendirmek için…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Mükemmeliyet Merkezleri Ontario ve Ontario Araştırma Fonundan JK hibe ile mümkün olmuştur.
Biz çekimler sırasında teknik yardım için Sıddıka Pardhan Dr. Peter Ferguson teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
