Оценка эффективности снадобья рака сенсибилизации<em> In Vitro</em> И<em> В Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
Из-за высокого уровня неоднородности и мутаций, присущих злокачественных опухолей человека, терапии монотерапии или комбинации препаратов, которые нацелены на один и тот же путь, скорее всего, не удастся. Упор должен быть сделан на ингибирование путей, ответственных за внутренней и / или адаптивной резистентности к терапии. Активное поле исследования является разработка и тестирование ингибиторов репарации ДНК, которые способствуют действия, и предотвратить сопротивление, обычно используется химиотерапии и лучевой терапии. Мы использовали новый протокол, чтобы оценить эффективность торможения BRCA2 в качестве средства для информирования опухолевых клеток с ДНК повреждающим цисплатин наркотиков. Метаболизм опухолевых клеток (подкисление и дыхание) отслеживали в режиме реального времени в течение 72 ч, чтобы очертить эффективность лечения на минуту за минутой основе. В сочетании, мы провели оценку метастатическим частоты с использованием куриного эмбриона хориоаллантойной мембраны (CAM) Модель кровоподтек и вторжения. ЭтоПротокол рассматриваются некоторые из недостатков, обычно используемых в пробирке и в методах естественных условиях, чтобы оценить режимы новые терапии рака. Он может быть использован в дополнение к обычным методам, таким как анализах пролиферации клеток, клеточной гибели анализов, и в естественных исследованиях на мышах ксенотрансплантатов, чтобы более точно различить среди кандидатов целей и агентов, и выбрать только наиболее перспективных кандидатов для дальнейшего развития.
Introduction
Приобретенная устойчивость к целенаправленной и / или лечения рака цитотоксические является важным клиническим проблема, которая может привести к неэффективности лечения, рецидивов, и увеличение смертности пациентов 1. Учитывая высокий уровень неоднородности в большинстве опухолей, что является математической уверенности, что опухоль достаточно большое количество клеток будет содержать подмножество клеток, устойчивых к одной или комбинированных препаратов, направленных на молекулярных путей, по которым эти клетки зависит выживание 2,3. Такие опухолевые клетки могут быть отобраны положительно во время лечения, что приводит к рецидива заболевания. Разработка новых методов лечения, которые одновременно нацелены на различные механизмы выживания раковых клеток, либо до, либо после выбора лечения опосредованного, таким образом, клинически значимым.
Высокий уровень нестабильности генома и мутации в геномах опухолевых является основной характеристикой, которая отличает раковые клетки от клеток-хозяев неопухолевых 4. Следовательно, usefuл стратегия повысить эффективность ДНК-повреждения химиотерапии и предотвратить развитие резистентности является активно ингибируют репарацию ДНК в опухолевых клетках 5. Это активное поле исследования и различных новых целей репарации ДНК в настоящее время изучаются в доклинических настройки. Количество малых молекул или антисмысловых на основе ингибиторов этих целей были разработаны и проходят испытания 6-8. Цель заключается в выявлении наиболее перспективных доклинические кандидатов и оценить их эффективность и безопасность в клинических испытаниях.
Высокая стоимость клинических испытаний и риск неудачи (по различным причинам, включая неоптимальной доклинических оценки) являются огромные препятствия на пути прогресса в разработке новых методов лечения 9. Использование соответствующих и строгих доклинических моделях адекватно оценить новые терапевтические цели и кандидаты препараты могут уменьшить высокий процент неудач клинических испытаний 10 </suP>.
Некоторые часто используемые доклинические методы оценки эффективности новых схем противораковых являются: а) измерение способности уменьшать пролиферацию опухолевых клеток в пробирке (пролиферации клеток анализах) б) снижение, терапия-индуцированного потенциала опухолевых клеток к Форма тканевых культур колонии (образование колоний анализы), с) уменьшение индуцированной терапии в метаболической активности опухолевых клеток в пробирке (конверсии окислительно-восстановительный краситель), г) терапии-индуцированной индукции в пробирке опухолевых клеток смерти (апоптоза, некротические, аутофагической, связанного с митоза и другие) 11 и Е), в естественных условиях терапии-индуцированной снижение роста или абляции человека и мыши ксенотрансплантатах 12-14.
Основным недостатком методов перечисленных в пробирке в том, что ни один из них не даёт постоянную оценку в режиме реального времени эффекта кандидатов терапии. Скорее, они предоставляют информацию только на отдельных, широко разделенных временных точкахв течение курса лечения. Такие измерения, утрата способности точно отражать величину и сроки ответов опухолевых клеток. В естественных условиях модели мыши ксенотрансплантата также ограничены высокой стоимостью, длина времени, чтобы завершить, и риск неоптимального дозирования и лечения времени (планирование). Кроме того, есть свидетельства, что модели грызунов ксенотрансплантатов ограниченные предсказатели клинической эффективности у людей, по сравнению с в пробирке оценки ответов первичных опухолевых клеток человека и установления клеточных линий опухолей человека кандидату терапевтических вмешательств 15,16.
Мы разработали новый протокол комбинации, чтобы оценить новые комбинации лекарственных средств до клинически, таким образом, устраняются недостатки наиболее распространенных процедур, указанных выше. На месте распространения, формирования колонии, или окислительно-восстановительной красителей анализов преобразования, мы использовали единицы измерения, метаболизм, чтобы проанализировать адгезию клеток, дыхание, и подкисления в режиме реального временив течение всего периода лечения 17. Одновременно, мы исследовали влияние комбинированного лечения в естественных условиях с помощью куриных эмбрионов хориоаллантойной мембрана (CAM) модели инвазии и метастазированию 18,19. Мы использовали эти методы для оценки способности антисмысловой олигонуклеотид (ASO) таргетирования BRCA2 усиливать эффективность широко используемого химиотерапевтического цисплатин наркотиков.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за присущей стоимости и риска, связанного с клинических испытаний, есть необходимость в разработке более и более строгий доклинических методика тестирования, чтобы адекватно оценить новые схемы лечения анти-раковые. Текущие часто используемые методы все проявляют слабые стороны, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа стала возможной благодаря грантов JK от Онтарио центров передового опыта и научно-исследовательского фонда Онтарио.
Мы хотели бы поблагодарить Siddika Pardhan и д-р Питер Фергюсон для оказания технической помощи во время съемок.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
