를 통해 교체 단백질 - 단백질 상호 작용의 억제제의 개발 : 설계 및 개발 비 ATP 경쟁 CDK 억제제에 응용
Summary
We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.
Abstract
보다 효율적으로 단백질 – 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)을 대상으로 개발 한 고유 REPLACE 전략이다. 그것은 잠재적 인 약물 표적의 대부분을 대표하는 이러한 결합 부위에 대한 억제제의 식별 및하는 개선 된 방법을 제공함으로써 약물 표적 가능한 공간을 확장하는 것을 목적으로한다. 본 연구의 주된 목적은 연산 및 합성 화학 접근법을 포함 REPLACE 전략의 사용과 애플리케이션의 방법론적인 개요를 제공하는 것이다. 비 ATP 경쟁 사이클린 의존성 키나제 (CDK) 항 종양 치료제 억제제의 개발에의 응용을 통해 예시 교체합니다. CDKs 자주 암에 규제가 완화되고, 따라서 약물 개발을위한 중요한 대상으로 간주됩니다. S 단계에서 CDK2 / 사이클린의 억제 E2F1 경로를 통하여 p53의 독립적 인 방식으로 암 세포의 선택적 사멸을 촉진하는 것으로보고되었다. 사이클린 bindin에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 표적g 홈 (CBG)는 전사 CDKs 통해 세포주기의 특정 억제를 허용 접근법이다. CBG는 CDK 기판 및 종양 억제 단백질에서 유래 합의 시퀀스 인식 모티브 (CBM)를 결합 사이클린라고합니다. CBM은 이전에 더 충분한 활동 (RRLIF)를 유지 펜타로 절단 한 후 p21Waf (HAKRRIF)과에서 octapeptide에 최적화되었습니다. 투과성 세포되지 않습니다 일반적으로 펩타이드, 대사 적으로 불안정하고 따라서 전략 REPLACE (전산 심화 학습을 통해 부분 리간드 대안으로 교체가) 더 마약 같은 억제제를 생성하기 위해 적용되어 있습니다. 이 전략은 선택적으로 세포주기 CDK / 사이클린 복합체를 저해 조각 결찰 억제 펩티드 (뒤집)의 설계로 시작합니다. 넘겼는 반복적으로 N- 말단 (Ncaps)에서 시작하여 작은 분자 (그룹 상한) 등의 단편 HAKRRLIF / RRLIF의 잔류 물을 대체하여 생성에 교체로 추적 관찰 하였다C 말단. 이들 화합물은 항 – 종양 치료제로서 비 ATP 경쟁적 CDK 억제제의 생성에 대한 포인트를 시작하고있다.
Introduction
이 글에서, 더 약학 관련 분자에 단백질 – 단백질 상호 작용의 펩티드 억제제를 변환 전략 REPLACE (계산 농축하여 부분 리간드 대안으로 교체)을 적용하는 사례 연구 1-3을 설명한다. 프로톤 펌프 억제제가 잠재적 인 약물 표적의 풍부한하지만 underexploited 소스를 나타내는 반면, 기존의 방법론이 널리 액세스 할 수 있도록 크게 부족하다. 단편 기반 디자인 4, 하이 스루풋 스크리닝 (5, 6)은 발전을 구비 한 스테이플의 펩티드를 포함한 현재 전략은, 그러나 이들은 많은 경우에 비효율적이다. 그 결과,보다 진보하고 더 효율적인 접근 방법이 요구된다. 완전히 약물 형 및 개선 된 특성을 항 종양 치료제로서 향후 개발 잠재력이있다 키나제 억제제의 개발에서 검증 된 교체한다. 이 전략은 셀의 비 ATP 억제제의 개발을들 수있다사이클 CDKs 및 다음과 같이 포함한다 : 1) 사이클린이 홈을 바인딩 HAKRRLIF / RRLIF의 상호 작용에 대한 3 차원 구조 정보를 획득하는 단계; 2) 펩티드의 상호 작용을위한 결합 중요한 결정 인자를 결정하는 단계; 하나 이상의 결합 결정 인자를 포함하는 펩티드의 N 말단 3) 절단; 펩타이드 및 그 중 절단 된 부분에 대한 잠재적 인 작은 분자 대안 4) 전산 식별 (부분 리간드 대안, PLAS) 부모 펩타이드의 키 상호 작용을 유지; 5)의 합성 또는 PLAS 상업적 소싱 이전 삭제 펩티드 잔기 (들)에 의해 점유 된 서브 사이트와 결합하는 열심 예측; 6) 고체상 합성을 이용하여 절단 된 펩티드 가장 PLAS 결찰 통해 뒤집의 합성 바인딩 시험관에 넘겼 또는 세포 생존 분석에서 더 특성화 다음 기능 분석 (CDK / 사이클린 맥락에서 형광 편광)의 7) 테스트. 전략에서 교체의 개략도Y는. 그림 1에 나타낸다이 글에서, 교체 전략의 반복을 논의하고 CDK2 / 사이클린에 응용 프로그램이 상세하게 설명. CDKs는 직접 또는 간접적으로 종양의 대부분의 규제가 완화 될 것으로 생각되며, 따라서 적절한 항암제 대상 7 여겨진다. CDKs는 완전한 활성화를 위해 사이클린과 연관이 필요하고이어서 세포주기 조절에 관여하는 주요 8 단백질 인산화. CDKs의 두 주요 그룹은 세포주기 체크 포인트를 제어 이소 타입 [G1 / S (CDK4 / 사이클린 D, CDK6 / 사이클린 D 및 CDK4 / 사이클린 E), S 상 (CDK2 / 사이클린 A) 및 G2 / M (CDK1 / 아르 사이클린 B)] 및 인산화를 통해 RNA 중합 효소의 규제 (CDK7 / 사이클린 H, CDK8 / 사이클린 C, 경우, Cdk9 / 사이클린 T). E2F1 전사 인자 후 DNA에 결합하고 유전자 전사를 개시 DP 단백질과 복합체를 형성 할 때 S 단계 진행에서 중요한 단계가 발생한다. CDK2 / 사이클린은 E2F1의 전사를 중화하는 데 필요한인산화를 통해 활동함으로써 E2F1-DP의 복잡하고 그 이후의 저하의 출시 선도. CDK2 / 사이클린의 억제는 그 DNA 결합 상태를 지속적으로 활성화 선도 E2F1을 유지하는 것으로 여겨진다. E2F-1 활성의 생성 수준은 따라서 치료 전략을 제안하는 p53의 독립적 아폽토시스를 유도하는 데 필요한 임계치를 능가 할 것이다. 인해 E2F-1 p53의 규제 완화와 PRB 경로, 높은 수준으로 빈번하게 종양에서 아폽토시스를 선택적으로 유도한다 암세포 및 CDK2 / 사이클린 억제 발생 및 암 검증 대상 (7)으로 간주 될 수있다.
임상 연구 CDK 억제제는 인간의 kinome에서보다 큰 500 단백질 키나제 중 반응성을 건너 이어지는 매우 보존 ATP 결합 부위를 대상으로 잠재적 효과와 독성 (9)쪽으로 상승을주는. 또 다른 방법은 CBG을 통해 기판의 채용을 대상으로 비 ATP 경쟁 저해입니다사이클린 긍정적 인 규제 서브 유닛에 존재하기 때문에 별개의 사이트 (10, 11)를 결합 ATP로부터 멀리 떨어져있다. CBG 주로 사이클린, 사이클린 D 및 사이클린 E에 존재하는 홈이고, 소수성 기판 및 종양 억제에 위치한 공통 서열을 인식하는 것으로 나타났다. 격리 된 펩타이드로서, 사이클린 결합 모티프 (CBM)는 CBG 결합하고 세포주기 CDKs의 키나제 활성을 억제하는 것으로 나타났다. CBM은 약물에 대한 분자량 사이 좋은 타협을 나타내는 펜타에 또한 절단 (HAKRRLIF, CDK2 / 사이클린 IC (50) 0.07 ± 0.02 μM, CDK4 / 사이클린 D IC (50) 0.88 ± 0.34 μM) octapeptide과 최적화 된 형상과 힘 (RRLIF, CDK2 / 사이클린 IC (50) 1.01 ± 0.17 μM, CDK4 / 사이클린 D, IC (50) 25.12 ± 2.97 μM) 12, 13. CBGs는 acidi에 의해 브리지되는 큰 주와 작은 차 소수성 포켓으로 구성C 지역은 (Glu220, Glu224 및 Asp283 포함). HAKRRLIF의 키 바인딩 결정은 산성 영역 및 기본 친 유성 사이트와 Leu6과 Phe8의 상보성의 높은 수준 Lys3,의 Arg 4 Arg5의 2 소수성 포켓, 이온 쌍과 수소 결합을 갖는 Ala2의 상호 작용을 포함한다. Ile7가 주 포켓 최적의 접촉을 허용하는 스페이서 잔기로 작용하면서 또한, 다수의 수소 결합은 펩타이드 골격으로부터 기여된다. 바인딩 모드와 CBG와 HAKRRLIF의 상호 작용은 그림 2에 표시됩니다.
CBM / CBG 단백질 – 단백질 상호 작용을 표적으로하는 CDK2 / 사이클린 A, CDK2 / 사이클린 E 및 CDK4 / 사이클린 D의 키나제 활성을 억제하며, 정상 세포 (7)에 영향을주지 않으면 서이 E2F1에게 암 세포 매개 세포 사멸을 유발한다. CBM 유래 펩타이드가 세포주기 CDKs의 효과적인 저해제가 있지만, 그들로 인해 대사 약물로서 유용 할 것 같지는 않다불안정과 세포 투과성의 일반적인 부족. 이를 위해, 우리는 CDK2 / 사이클린을 억제 규제 완화 E2F1을 이용한 항암 치료제의 발전을 위해 더 많은 약물 같은 화합물로 이러한 강력한 펩타이드 억제제를 변환하기 위해 교체 전략을 적용했습니다. 다음 프로토콜은 사이클린 홈에 교체의 응용 프로그램에서 완성 된 작품을 요약 한 것입니다. 첫번째 예에서, HAKRRLIF의 N 말단 테트라위한 약물과 같은 캡핑기를 교체가 확인되었다. 또한이 그룹의 개선은 교체에 대한 추가 검증 연구에서 조사 하였다. 이 연구에서 대표 결과도 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr’s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.
Materials
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, , Micro pipets, | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT), | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates, | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent, | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter. | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of ‘druggable’ targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l. Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes. ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M. Improving peptides. Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
