Разработка ингибиторов белок-белковых взаимодействий через REPLACE: Приложение к проектированию и развитию Номера ATP Конкурсная CDK ингибиторов
Summary
We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.
Abstract
REPLACE является уникальная стратегия разработана для более эффективного целевого белок-белковых взаимодействий (ИЦП). Она направлена на расширение доступной целевой препарат пространство, обеспечивая улучшенное методологию для идентификации ингибиторов для таких сайтов связывания и которые представляют большинство потенциальных мишеней для лекарственных средств. Основная цель данной работы заключается в предоставлении методологической обзор использования и применения REPLACE стратегии, которая включает в себя вычислительные и синтетические подходы химии. REPLACE иллюстрируется с помощью его применения к развитию не ATP конкурентоспособной циклинзависимых киназ (CDK) ингибиторов в качестве противоопухолевых терапии. CDKs часто дерегулирование рака и, следовательно, рассматриваются как важные цели для разработки лекарств. Ингибирование CDK2 / циклин А в S фазе, как сообщалось, способствуют селективной апоптоз раковых клеток в р53 независимым образом через E2F1 пути. Ориентация белок-белкового взаимодействия в циклин bindinг паз (ЦБС) является подход, который позволит специфическое ингибирование клеточного цикла в течение транскрипционных CDKs. ЦБС признан консенсусной последовательности, полученной из CDK субстратов и супрессоров опухоли белка называется циклин связывающий мотив (CBM). Сообщение Cell Broadcast ранее была оптимизирована с октапептидом от p21Waf (HAKRRIF), а затем дополнительно усекается до пентапептида сохраняя достаточную активность (RRLIF). Пептиды в общем не клетки проницаемыми, метаболически нестабильны и поэтому REPLACE (замена с частичным лиганда Альтернативы через Вычислительная обогащение) стратегии был применен для того, чтобы генерировать более ингибиторов наркотиков, как. Стратегия начинается с разработки фрагмента лигировали тормозных пептидов (переворачивает), которые селективно ингибируют клеточного цикла CDK / циклин комплексы. Переворачивает были получены путем итеративного замены остатков HAKRRLIF / RRLIF с фрагментом, как малых молекул (укупорки группы), начиная с N-конца (НКПД), с последующей заменой наС-конец. Эти соединения представляют собой отправную точку для генерации без АТФ конкурентных ингибиторов CDK в качестве противоопухолевых терапии.
Introduction
В этой статье, на примере применения Replace (Замена с частичным использованием лигандов альтернатив вычислительную обогащение) стратегию, чтобы преобразовать пептидные ингибиторы белок-белковых взаимодействий в более фармацевтически соответствующих молекул описывается 1-3. В то время как ИПП представляют собой богатый источник, но недоиспользуются потенциальных мишеней для лекарственных средств, существующие методологии в значительной степени недостаточно, чтобы сделать эти широко доступны. Современные стратегии в том числе на основе фрагмента конструкция 4, высокопроизводительного скрининга 5 и скрепленных пептидов 6 предоставили авансы, однако они во многих случаях неэффективной. В результате, больше прогресса и более эффективные подходы. ЗАМЕНЫ была полностью подтверждена в развитии ингибиторов киназ, которые обладают улучшенными свойствами с наркотиками, как и у потенциал для дальнейшего развития в качестве противоопухолевых терапевтических. Эта стратегия проиллюстрировано в развитии не-АТФ ингибиторов клеткицикл CDKs и включает в себя следующее: 1) получение 3D структурную информацию о взаимодействиях HAKRRLIF / RRLIF с циклин связывания паз; 2) определение важных обязательных определителей для пептида взаимодействия; 3) усечение пептидов N-конца, содержащего один или более св зывани; 4) вычислительная идентификации потенциальных малых молекул альтернатив (частичные лиганд альтернативы, Plas) для усеченного части пептида и которые сохраняют основные взаимодействия исходного пептида; 5) синтез или коммерческой источников пла предсказал связать с жадностью к югу сайте ранее занимаемой удалены пептида остатка (ов); 6) синтез просматривает лигирования лучших лить с укороченным твердофазного синтеза пептидов с использованием; 7) проверка переворачивает в лабораторной связывания или функциональном анализе (поляризация флуоресценции в контексте / циклин CDK) с последующим дальнейшей характеристики в жизнеспособности клеток анализом. Схематическое представление ЗАМЕНИТЬ STRATEGу показано на рисунке 1. В этой статье итераций REPLACE стратегии обсуждаются и приложение к CDK2 / циклин А описан подробно. CDKs, как полагают, прямо или косвенно отменено в большинстве опухолей и, следовательно, считаются подходящими рака лекарственных препаратов 7. CDKs требует объединения с циклинов для полной активации, а затем фосфорилировать ключевых белков, участвующих в регуляции клеточного цикла 8. Две основные группы CDKs являются изотипы, которые контролируют контрольных точек клеточного цикла [G1 / S (CDK4 / циклин D, CDK6 / циклин D и CDK4 / циклин Е), S фаза (CDK2 / циклин А) и G2 / M (CDK1 / циклин В)] и регуляторы РНК-полимеразы посредством фосфорилирования (CDK7 / циклин Н, CDK8 / циклин C, CDK9 / циклин Т). Ключевой стадией в фазе прогрессирования S возникает, когда коэффициент E2F1 транскрипции образует комплекс с белком DP, который затем связывается с ДНК и инициирует транскрипцию гена. CDK2 / циклин А необходим для нейтрализации E2F1 транскрипциидеятельность посредством фосфорилирования что приводит к высвобождению комплекса E2F1-DP и его последующей деградации. Ингибирование CDK2 / циклин А, как полагают, поддерживать E2F1 в его ДНК связанное состояние приводит к постоянной активации. Полученный уровень E2F-1 активности превысит порога, необходимого, чтобы вызвать апоптоз p53 независимого поэтому предлагая терапевтическую стратегию. Благодаря дерегулированном p53 и PRB путей, высокие уровни E2F-1 часто встречаются в раковых клетках и ингибирование CDK2 / циклин А должно приводить к селективной апоптоза в опухолях и может рассматриваться в качестве утвержденного цели рака 7.
Клинически исследованные ингибиторы CDK целевой высоко консервативными ATP сайт связывания, ведущий к перекрестной реактивности среди протеинкиназ больше, чем 500 в человеческом kinome и потенциально порождая побочные эффекты и токсичность 9. Альтернативный подход не является АТФ конкурентное ингибирование путем охвата вербовки субстрата через ЦБСприсутствует на циклин положительной регуляторной субъединицы и который, следовательно, различны и далеки от АТФ сайт связывания 10,11. ЦБС в основном гидрофобный канавки присутствуют в циклин A, циклин D и циклин Е, и было показано, чтобы распознать консенсусную последовательность найти в субстратах и опухолевых супрессоров. В качестве выделенного пептида, циклин-связывающий мотив (СВМ) связывается с ЦБС и было показано, ингибируют активность киназы из CDKs клеточного цикла. Сообщение Cell Broadcast была оптимизирована с октапептидом (HAKRRLIF, CDK2 / циклин A IC 50 0,07 ± 0,02 мкМ, CDK4 / циклин D, IC 50 0,88 ± 0,34 мкм) и, кроме того, усеченная на пентапептида, представляющей собой хороший компромисс между молекулярной массой для лекарственной Сходство и потенция (RRLIF, CDK2 / циклин IC 50 1,01 ± 0,17 мкМ, CDK4 / циклин D, IC 50 ± 2,97 25,12 мкм) 12,13. В CBGs состоят из большого начального и среднего меньшего гидрофобного кармана, которые мостовом помощью ACIDIС-область (включает Glu220, Glu224 и Asp283). Ключевые связывания детерминанты включают HAKRRLIF взаимодействие Ala2 с вторичным гидрофобным карманных, ионных пар и водородных связей Lys3, Arg 4 и Arg5 с кислой области и высокой степенью комплементарности Leu6 и Phe8 с первичным липофильного сайта. Кроме того, многочисленные водородные связи вклад от позвоночника, а пептида Ile7 действует как разделительный остатка, позволяя оптимальный контакт с первичной кармане. Связывание режим и взаимодействия с HAKRRLIF ЦБС показано на рисунке 2.
Ориентация белок-белкового взаимодействия МУП / ЦБС будет препятствовать активность киназы CDK2 / циклин А, CDK2 / циклин E & CDK4 / циклин D, и это должно вызвать E2F1 опосредованного апоптоза раковых клеток, не затрагивая нормальные клетки 7. Несмотря на то, МД Пептиды являются эффективными ингибиторами клеточного цикла CDKs, то маловероятно, что они будут полезны в качестве лекарственных средств из-за их метаболическойнестабильность и общее отсутствие клеточной проницаемости. Для этого, мы применили Заменить стратегию для того, чтобы превратить эти мощные ингибиторы пептидные в более наркотиков, как соединений для дальнейшего развития противоопухолевых терапевтических эксплуататорских дерегулированный E2F1 через CDK2 / циклин A торможение. Следующий протокол обобщает работу, которая была завершена в применении заменит циклин канавки. В первую очередь, были определены наркотиков, как покрывать группы замены для N-концевого тетрапептида HAKRRLIF. Кроме того улучшения в этих группах были исследованы в качестве дополнительного исследования для проверки ЗАМЕНИТЬ. Представитель результаты этих исследований также представлены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr’s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.
Materials
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, , Micro pipets, | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT), | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates, | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent, | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70c freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter. | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
- Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
- Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
- McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).
- Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
- Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of ‘druggable’ targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
- Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
- Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
- Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l. Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
- Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
- Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
- Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes. ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).
- Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
- McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
- Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
- Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
- Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
- Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
- Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
- Thayer, A. M. Improving peptides. Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).
- Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
- Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
- Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).
