جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج الوظيفية الجيوب الأنفية الأنسجة العقدية من الخلايا الجذعية المحفزة الفئران (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression بالإضافة إلى القلب-الميوسين الثقيلة سلسلة (Myh6) اختيار المضادات الحيوية المروج يؤدي إلى نقية للغاية المجاميع خلية تنظيم ضربات القلب. هذه "التي يسببها الجيبية الأذينية-الهيئات" ("iSABs") تحتوي على أكثر من 80٪ خلايا تنظيم ضربات القلب، وتظهر زيادة معدلات عالية الضرب وقادرة على عضلة القلب وتيرة فيفو السابقين.
Abstract
ويستند العلاج من "متلازمة الجيوب الأنفية المرضى" على أجهزة ضبط نبضات القلب الاصطناعي. هذه تحمل مخاطر مثل فشل البطارية والالتهابات. وعلاوة على ذلك، فإنها تفتقر الاستجابة الهرمونات والإجراء العام هو مكثفة من حيث التكلفة. "أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية" ولدت من شركات الأمن الخاصة قد يصبح بديلا، إلا أن المحتوى نموذجية من خلايا تنظيم ضربات القلب في الهيئات مضغي الشكل (EBS) منخفضة للغاية. بروتوكول صفها يجمع بين "البرمجة إلى الأمام" الأمنية الخاصة من الفئران عبر العقدة الجيب محفز TBX3 مع اختيار المضادات الحيوية Myh6-المروج مقرها. هذا ينتج المجاميع cardiomyocyte متسقة من> 80٪ خلايا تنظيم ضربات القلب وظيفية من الناحية الفسيولوجية. هذه "التي يسببها الجيبية الأذينية-الهيئات" ("iSABs") والتعاقد بشكل عفوي على ترددات بعد لم يتم الوصول إليها (400-500 نبضة في الدقيقة) المقابلة لخلايا عقدية المعزولة من قلوب الماوس، وتمكن من وتيرة عضلة القلب الفئران خارج الحي. باستخدام بروتوكول وصف الجيوب الأنفية نقية للغايةيمكن توليد الخلايا واحد العقدي الذي مثل يمكن استخدامها لاختبار المخدرات في المختبر. وعلاوة على ذلك، قد تصبح iSABs ولدت وفقا لهذا البروتوكول خطوة حاسمة نحو هندسة الأنسجة القلبية.
Introduction
مصطلح "متلازمة الجيوب الأنفية المرضى" تلخص أمراض متعددة مما يؤدي إلى تدهور نظام تنظيم ضربات القلب القلب. وهي تتألف من المرضي، أعراض بطء القلب الجيبي، كتلة الجيبي الأذيني واعتقال الجيوب الأنفية وكذلك متلازمة عدم انتظام دقات القلب، بطء القلب. وبالتالي، غالبا ما يترافق من "متلازمة العقدة الجيبية المريضة" عن أمراض القلب التي العامة مثل مرض القلب الإقفاري، بعضلة القلب أو التهاب عضلة القلب. في الوقت الحاضر، وتعتمد الطرق العلاجية على زرع أجهزة ضبط نبضات القلب الكهربائية. ومع ذلك، وهذا يسير جنبا إلى جنب مع عدد من المخاطر مثل الالتهابات وفشل البطارية. وعموما، فإن نسبة حدوث مضاعفات لا يزال مرتفعا جدا في المرضى بعد زرع جهاز تنظيم ضربات القلب الاصطناعي و. وعلاوة على ذلك، خلافا لتنظيم ضربات القلب الذاتية، وهذه الأجهزة لا تستجيب لتحفيز الهرمون.
وثمة بديل في المستقبل قد تعتمد على توفر "أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية" التي يمكن أن تكون الأمنية الخاصةكمصدر الخلوي مناسبة والتي من شأنها أيضا أن تكون ذات قيمة للغاية لفي المختبر اختبار المخدرات. ومع ذلك، ومشكلة كبيرة تكمن في ظهور نادر جدا من الخلايا العقدية الجيوب الأنفية داخل هيئات مضغي الشكل (EBS) – وهذا عادة لا تتجاوز 0.5٪ ~ 1.
سابقا، فقد تبين أن "البرمجة إلى الأمام" نحو فرعية cardiomyocyte محددة أمر ممكن التحقيق عبر overexpression من أوائل متميزة عوامل النسخ القلب والأوعية الدموية مثل عامل الأديم المتوسط محددة-الخلفي 1 (MesP1) وNK2 النسخ ذات الصلة، موضع 5 (Nkx2.5) 2، 3. لالحجم العادي وظيفة العقدة الجيبية الأذينية (SAN)، وT-مربع عامل النسخ Tbx3 أمر بالغ الأهمية، وهو ما ثبت لبدء برنامج الجين تنظيم ضربات القلب والسيطرة على التفريق بين SAN 4. في حين أن هذا عزز ظهور خلايا تنظيم ضربات القلب وظيفية، والمحتوى لا يزال لم تتجاوز ~ 40٪ خلال كامل سكان الخلية cardiomyocytic.
لذلك، تم إدخال خطوة اختيار المضادات الحيوية إضافي Myh6-المروج استنادا 5 من قبلنا. هذا يؤدي في النهاية إلى المجاميع cardiomyocyte بعد غير ملحوظة ("الهيئات التي يسببها صينية الأذيني." iSABs ") والتي تظهر زيادة شديدة الترددات الضرب (> 400 نبضة في الدقيقة) في المختبر، للمرة الأولى تقارب تلك التي في القلب الفئران وقابلة للمقارنة لزراعتها في المختبر الجيوب الأنفية الخلايا العقدية معزولة من قلب الفئران 6. تحت الإدارة إيزوبرينالين تتحقق حتى الترددات الضرب من 550 نبضة في الدقيقة. والجدير بالذكر أن تتكون iSABs لأكثر من 80٪ خلايا عقدية وظيفية واضحة اعتبارا من الفسيولوجية واسعة يحلل 7. في الآونة الأخيرة، عدة نهج لتوليد الجيوب الأنفية الخلايا العقدية باستخدام برمجة المباشرة 19، السطح علامات 14 أو العلاج الدوائي مع جزيئات صغيرة وصفت 16،17. ومع ذلك، وأيا من هذه الطرق أدت إلى مثل هذه نقاء عالية من خلايا تنظيم ضربات القلب وينبض ترددات قريبة من الفئران انهالفن كما لوحظ في iSABs.
وعلاوة على ذلك، في نموذج المجراة سابقا من المزروعة شرائح البطين الماوس الكبار التي فقدت النشاط الضرب العفوي بهم، وiSABs هي قادرة على الاندماج في نسيج شريحة، وبالتالي تبقى نشطة بشكل عفوي وبقوة سرعة شرائح القلب لتقلصات 7. ووصف بروتوكول مفصلة لتوليد هذه iSABs في هذه الورقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على إنتاج الخلايا الجذعية المستمدة خلايا تنظيم ضربات القلب القلب قد تسمح إعادة تشكيل إيقاع القلب السليم بمعنى "أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية". وبالمثل، فإن اختبار المخدرات في المختبر تستفيد من توافرها. يمكن الأمنية الخاصة تؤدي إلى أي نوع من الخلايا ف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
