MYH6プロモーター - 選択と組み合わせたES細胞のプログラミングに基づいて、マウス心臓ペースメーカー細胞凝集体の生成
Summary
このプロトコルは、マウス多能性幹細胞（PSC）から機能洞結節組織を生成する方法について説明します。 T-BOX3（TBX3）過剰発現プラス心臓ミオシン-重鎖（MYH6）プロモーター抗生物質選択は、高純度のペースメーカー細胞凝集につながる。これらの「誘導された-洞房-体」（「iSABs」）、80％以上のペースメーカー細胞を含む非常に増加鼓動率を示し、ex vivoで心筋をペーシングすることができます。
Abstract
「洞不全症候群」の治療は、人工ペースメーカーに基づいています。これらには、バッテリ障害や感染症などの危険を負担する。さらに、それらは、ホルモン応答性を欠いており、全体的な手順は、コスト集約的である。のPSCから生成された「生物学的ペースメーカーは、「代替になることがあり、まだ胚様体（EB）におけるペースメーカー細胞の典型的な含有量は極めて低い。記載されているプロトコルはMYH6プロモーターベースの抗生物質選択で洞結節デューサTBX3 を経由して 、ネズミのPSCの「前方プログラミング」を兼ね備えています。これは> 80％の生理学的に機能的なペースメーカー細胞の一貫性の心筋細胞凝集体が得られます。これらの「誘導された-洞房-体」（「iSABs」）自発的にマウス心臓から単離したリンパ節の細胞に対応するまだ未達の周波数（400〜500 BPM）に委託し、ex vivoでのマウス心筋をペーシングすることができますされている。記載されているプロトコル高純度洞の使い方結節単一細胞は、in vitro薬物試験のために使用することができる例を生成することができる。さらに、このプロトコルに従って生成iSABsは、心臓組織工学に向けての重要なステップになることがある。
Introduction
用語「洞不全症候群は、「心臓ペースメーカーシステムの劣化につながる複数の疾患をまとめたもの。それは病的な、症候性洞性徐脈、洞房ブロック、洞停止だけでなく、頻脈、徐脈症候群を含む。これにより、「洞不全症候群」は、多くの場合、虚血性心疾患、心筋症または心筋炎などの一般的な心疾患を伴っている。現在、治療のアプローチは、電気的ペースメーカーの移植に基づいている。しかし、このような感染症やバッテリ障害などのリスクの数と共に進む。全体として、合併症の発生率は、人工ペースメーカーを移植した患者では依然として非常に高い。内因性のペースメーカーとは対照的に、また、これらのデバイスは、ホルモン刺激に応答しない。
将来の選択肢はいるのPSCが役立つことができる「生物学的ペースメーカー」の利用可能性に依存してもよい適切な細胞源とそれはまた、インビトロ薬物試験のために非常に有用であるように。しかし、大きな問題は、胚様体（EB）内の洞結節細胞の非常にまれな外観にある-これは通常、〜0.5％1を超えない。
以前は、それが特定の心筋細胞のサブタイプに向かって「前方プログラミング」は、関連する中胚葉、固有事後1（MesP1）及びNK2転写因子、遺伝子座5（Nkx2.5の）2のような明確な早期の心血管系の転写因子の過剰発現を介して実行可能であることが示された、 3。洞房結節（SAN）の通常のサイズおよび機能のために、Tボックス転写因子TBX3ペースメーカー遺伝子プログラムを開始し、SAN 4の分化を制御することが示されている、非常に重要である。これは機能的ペースメーカー細胞の出現を高めながら、コンテンツがまだ全体cardiomyocytic細胞集団内の約40％を超えなかった。
したがって、追加のMYH6プロモーターベースの抗生物質選択ステップ5は、私たちによって導入された。 in vitroでの栽培にネズミの心臓のものと同等のを近似初めてin vitroで非常に増加鼓動の周波数（> 400 BPM）を示す;これは最終的にまだ未観測心筋細胞凝集体（iSABs「「誘導された洞房体」）につながるマウスの心臓6から分離洞結節細胞。イソプレナリン政権下では550 BPMのさえ破っ周波数が達成される。注目すべきは、iSABsは7を解析して大規模な生理的から明らかなように、80％以上の機能的な結節細胞で構成されています。最近では、直接リプログラミング19を使用して、洞結節細胞を生成するには、いくつかのアプローチが、表面が16,17が記述された小分子との14または薬理学的治療マーカー。しかし、これらの方法はいずれも、ペースメーカー細胞のような高純度につながっていないと、マウスに近い周波数を破って、彼iSABsで観察されたように芸術。
さらに、それらの自発的な拍動活性を失った栽培成体マウス脳切片のex vivoモデルにおいて、iSABsそれによって自発的にアクティブ残りとロバスト収縮7に心臓切片ペーシング、スライス組織に組み込むことができる。これらのiSABsを生成するための詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞由来の心臓ペースメーカー幹細胞生産能」とは、生物学的ペースメーカー」の意味での適切な心臓リズムの再構成を可能にすることができる。同様に、in vitroでの薬物検査は、それらの利用の恩恵を受ける。 PSCがペースメーカー細胞特性8,9,10,11,12,13心筋細胞を含む哺乳動物の体の任意の細胞型を生じさせることができる。しかし、典型的には、「胚様ボディ」内の細胞集団は、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
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