Detta protokoll beskriver hur man producerar funktionell sinus nodal vävnad från murina pluripotenta stamceller (PSC). T-Box3 (TBX3) uttryck plus kardiomyosin-tung kedja (Myh6) promotor antibiotikaselektion leder till mycket rena pacemaker cellaggregat. Dessa "Inducerade-sinoatriellt-organ" ("ISAbS") innehåller över 80% pacemakerceller, visar starkt ökad beating hastigheter och kan takten myokardiet ex vivo.
Behandling av "sick sinus syndrom" är baserad på artificiella pacemakers. Dessa bär risker som batterifel och infektioner. Dessutom saknar de hormon lyhördhet och den totala proceduren är kostnadskrävande. "Biologiska pacemakrar" som genereras från PSC: er kan bli ett alternativ, men den typiska halten av pacemakerceller i Embryoid organ (EBS) är extremt låg. Den beskrivna protokollet kombinerar "framåt programmering" av murina PSC via sinusknutan inducerare TBX3 med Myh6-promotor baserad antibiotikaselektion. Detta ger cardiomyocyte aggregat konsekventa av> 80% fysiologiskt funktionella pacemakerceller. Dessa "inducerade-sinoatriellt-organ" ("ISAbS") är spontant upphandlande vid ännu onådda frekvenser (400-500 bpm) motsvarande knutpunkter celler isolerade från mus hjärtan och kan stimulera murina hjärtmuskeln ex vivo. Använda beskrivna protokollet högren sinusknutpunkter enskilda celler kan genereras som t.ex. kan användas för in vitro-drogtestning. Vidare kan ISAbS genererade enligt detta protokoll blir ett avgörande steg mot hjärtvävnadsteknik.
Termen "sick sinus syndrom" sammanfattar flera sjukdomar som leder till försämring av hjärtpacemakersystem. Den består av patologisk, symptomatisk sinusbradykardi, sinoatriellt block, sinusstillestånd liksom takykardi-bradykardi syndrom. Därmed är en "sick sinus syndrom" ofta åtföljs av allmänna hjärtsjukdomar såsom en ischemisk hjärtsjukdom, kardiomyopati eller myokardit. För närvarande, är terapeutiska metoder baserade på implantation av elektriska pacemakers. Men går detta tillsammans med ett antal risker såsom infektioner och batterifel. Sammantaget är förekomsten av komplikationer fortfarande mycket hög hos patienter med implanterade en artificiell pacemaker. Vidare, i motsats till den endogena pacemaker, dessa anordningar inte svarar på hormonstimulering.
Ett framtida alternativ kan åberopa att det finns "biologiska pacemakers" för vilka gemensamma kontaktpunkter kunde tjänasom en lämplig cellulär källa, och som skulle också vara mycket värdefulla för in vitro-drogtestning. Ändå ett stort problem ligger i den mycket sällsynta utseende sinus nodal celler inom embryoidkroppar (EBS) – detta normalt inte överstiger ~ 0,5% 1.
Tidigare har det visat sig att "framåt programmering" mot specifika cardiomyocyte subtyper är genomförbart via överuttryck av distinkta tidiga kardiovaskulära transkriptionsfaktorer såsom mesoderm specifika-posterior 1 (MesP1) och NK2 transkriptionsfaktor relaterade, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. För normal storlek och funktion sinusknutan (SAN), är T-box transkriptionsfaktor Tbx3 avgörande, som har visat att initiera pacemakern genen programmet och för att kontrollera differentiering av SAN 4. Medan denna förbättrade utseendet av funktionella pacemakerceller, innehållet fortfarande inte översteg ~ 40% inom hela cardiomyocytic cellpopulationen.
Därför gjordes en extra Myh6-promotor baserad antibiotikaselektion steg 5 införs genom oss. Detta leder i slutändan till ännu obemärkt cardiomyocyte aggregat ("inducerade sinoatriellt organ;" ISAbS ") som uppvisar mycket ökade slå frekvenser (> 400 bpm) in vitro, för första gången som närmar de av en mus hjärta och jämförbar med in vitro-odlade sinus nodal celler som isolerats från en mus hjärta 6. Under Isoprenalin administrationen ens slå frekvenser av 550 bpm uppnås. Noterbart ISAbS består av över 80% funktionella nodala celler som framgår av omfattande fysiologiska analyser 7. Nyligen, flera metoder att generera sinus nodal celler med direkt omprogrammering 19, markörer ytan 14 eller farmakologisk behandling med små molekyler 16,17 beskrevs. Ändå har ingen av dessa metoder har lett till en sådan hög renhet av pacemakerceller och slå frekvenser nära den murina hankonst som observerats i ISAbS.
Dessutom i en ex vivo-modell av odlade vuxen mus ventrikulär skivor som har förlorat sin spontana stryk aktivitet, de ISAbS är kapabla att integreras i den del vävnaden och därmed kvar spontant aktiva och robust pacing hjärtat skivor till sammandragningar 7. En detaljerat protokoll för generering av dessa ISAbS beskrivs i detta dokument.
Förmågan att producera stamcells härledda pacemaker celler kan tillåta beredning av rätt hjärtrytmen i betydelsen "biologiska pacemakers". Likaså kommer drogtestning in vitro dra nytta av deras tillgänglighet. PSC: er kan ge upphov till någon celltyp av däggdjurskroppen inklusive kardiomyocyter med pacemaker cellegenskaper 8,9,10,11,12,13. Men vanligtvis cellpopulationer inom "Embryoid organ" är mycket heterogen, vilket oundvikligen leder till kravet på tillförlitliga strategi…
The authors have nothing to disclose.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
Tissue culture flask | TPP | 90076 |
Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |