Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성
Summary
이 프로토콜은 쥐의 다 능성 줄기 세포 (PSC)에서 기능 동 노드 조직을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. T-Box3 (TBX3) 과발현 플러스 심장 미오신 헤비 체인 (Myh6) 발기인 항생제 선택은 고순도의 페이스 메이커 세포 집합체로 연결됩니다. 이러한 "유도 – 동방 – 몸"( "iSABs")는, 고도의 박동 속도를 증가 보여 80 %의 심장 박동 세포를 포함하고 심근 생체 조절이 할 수 있습니다.
Abstract
"아픈 부비동 증후군 '의 치료는 인공 심장 박동기를 기반으로합니다. 여기에는 배터리 오류 및 감염 등의 위험을 부담. 또한, 그들은 호르몬 응답이 부족하고 전반적인 절차는 비용 집약적이다. PSC를에서 생성 된 "생물 페이스 메이커"는 대안이 될 수있다, 아직 배아의 몸에서 심장 박동 조절 세포의 일반적인 내용 (사채)는 매우 낮다. 설명 프로토콜은 Myh6 발기인 기반 항생제 선택과 부비동 노드 유도의 TBX3을 통해 쥐의 PSC를의 "앞으로 프로그래밍"을 결합합니다. 이> 80 % 생리 학적 기능성 페이스 메이커 세포의 일관된 심근 집계를 산출한다. 이러한 "유도 동방-몸은"( "iSABs") 자발적으로 마우스 마음에서 고립 마디 세포에 해당 아직 미전도 주파수 (400 ~ 500 BPM)에서 계약과 쥐의 심근 생체 조절이 할 수 있습니다. 설명 프로토콜 고순도의 동을 사용하여절점 단셀 약물은 시험 관내 시험을 위해 사용될 수있는 예를 생성 할 수있다. 또한,이 프로토콜에 따라 생성 된 iSABs 심장 조직 공학을 향한 중요한 단계가 될 수 있습니다.
Introduction
용어 "아픈 부비동 증후군은"심장 맥박 조정기 시스템의 악화로 이어지는 여러 질병을 요약 한 것입니다. 그것은 병적 인 증상이 동 서맥, 동방 블록, 부비동 체포뿐만 아니라 빈맥 – 서맥 증후군을 포함한다. 이로써, "아픈 부비동 증후군"은 종종 심근 허혈, 심근 병증 심근염 또는 일반적으로 심장 질환을 수반한다. 현재 치료 방법은 전기 맥박 조정기의 주입을 기반으로합니다. 그러나,이 같은 감염과 배터리 고장 등의 위험 번호와 함께 간다. 전반적으로, 합병증의 발생률은 여전히 환자가 인공 심장 박동기를 이식하는 데에 매우 높습니다. 내인성 박동기 반대로 더욱이, 이러한 장치는 호르몬 자극에 반응하지 않는다.
미래의 대안이되는 PSC를가 봉사 할 수 있었다 "생물학적 페이스 메이커"의 가용성에 의존 할 수있다적합한 셀룰러 소스와 어떤으로 또한 체외 약물 검사에 매우 유용 할 것입니다. 그러나, 큰 문제가 배아 체 (사채) 내에서 동 노드 세포의 매우 드문 모양에있다 – 이것은 일반적으로 ~ 0.5 % 1을 초과하지 않는다.
이전에는 특정 심근 서브 타입을 향해 "앞으로 프로그래밍"등 관련 중배엽 – 별 후방 1 (MesP1) 및 NK2 전사 인자 궤적 5 (Nkx2.5) 2와 별개의 조기 심장 혈관 전사 인자의 과발현을 통해 가능하다 것으로 나타났다, 3. 보통 크기와 동방 노드 (SAN)의 기능을 위해, T-박스 전사 인자 TBX3는 페이스 메이커 유전자 프로그램을 개시하고 SAN (4)의 분화를 제어하기 위해 도시 된, 결정적이다. 이는 기능상 박동기 세포의 모양을 개선하면서, 콘텐츠는 여전히 전체 cardiomyocytic 세포 집단 내에서 ~ 40 %를 초과하지 않았다.
따라서, 추가 Myh6 발기인 기반 항생제 선택 5 단계를 우리가 도입되었다. 체외 배양에 쥐 심장의 사람들과 비교를 근사 처음으로 체외에서 높은 증가 박동 주파수 (> 400 BPM)를 전시; 이것은 궁극적으로 아직 관찰되지 심근 집계 (iSABs ""유도 된 중국 – 심방 기관 ")에 리드 쥐의 심장 (6)에서 분리 된 동 결절 세포. 이소 프레 날린 관리에서 550 BPM 심지어 구타 주파수를 얻을 수있다. 특히, iSABs 7을 분석하여 광범위한 생리에서 명백한 바와 같이 80 % 이상 기능 림프절 세포로 구성되어 있습니다. 최근, 다양한 접근이 직접 리 프로그래밍 (19)을 이용하여 상악동에게 결절 세포를 생성하기 위해, 표면 (16, 17)에 대하여 설명 하였다 소분자 약물 치료 14 또는 마커. 그러나, 이러한 방법 중 어느 것도 페이스 메이커 세포의 이러한 높은 순도 주도하지 않고 쥐에 가까운 주파수를 치고 그예술 iSABs에서 관찰.
또한, 자신의 자율 박동 활동을 잃었다 재배 성인 마우스 심실 조각의 생체 모델, iSABs는 슬라이스 조직으로 통합하여 자발적으로 활성 남아있는 견고하게 수축 7 심장 조각을 페이싱 할 수있다. 이 iSABs의 생성에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
능력 "생물학적 박동기"의 의미로 적절한 심박동의 재구성을 허용 할 수있다 세포 유래 심장 페이스 메이커의 줄기 세포를 생성한다. 마찬가지로, 시험관 내에서 약물 검사는 가용성 도움이됩니다. PSC를 페이스 메이커의 셀 속성 8,9,10,11,12,13와 심근을 포함한 포유 동물의 신체의 세포 유형을 야기 할 수 있습니다. 그러나, 전형적으로 "배양체"내의 세포 집단은 필연적으로 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
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