تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Summary

وجود العديد من الطرق المختلفة لقياس الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية) باستخدام التدفق الخلوي (FCM). وينبغي النظر في العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. يتم عرض بروتوكولين لقياس المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة.

Abstract

خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع بوابات في و عقلانيةashion أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبة لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.

Introduction

خارج الخلية الحويصلات (المركبات الكهربائية) هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك بشكل كبير في التواصل خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام التدفق الخلوي (FCM) بالغ الصعوبة نظرا لصغر حجمها وقلة السكان منفصلة إيجابي لعلامات من الفائدة. طرق للتحليل EV، في حين تحسنت تحسنا كبيرا على مدى العقد الماضي، لا يزال التقدم في العمل. لسوء الحظ، ليس هناك مقاس واحد يناسب الجميع البروتوكول، ويجب اعتبار العديد من الجوانب عند تحديد أنسب طريقة للاستخدام. المقدمة هنا عدة تقنيات مختلفة لمعالجة المركبات الكهربائية وبروتوكولين لتحليل المركبات الكهربائية باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. الأساليب المذكورة هنا سوف تساعد في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع بوابات في و عقلانيةashion أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبة لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.

المركبات الكهربائية، المعروف أيضا باسم المجهرية الدقيقة، هي، الحويصلات المشتقة من غشاء صغيرة وجدت في سوائل الجسم التي تشارك في الاتصالات خلية خلية وتساعد على تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ^1. من خلال التعبير عن علامات سطح مختلفة و / أو التحويل المباشر للمواد البيولوجية والمركبات الكهربائية قادرة على تغيير وظيفة الخلايا المتلقية للعب إما تفعيل أو قمع الأدوار في التواصل بين الخلايا ^2-4. ومن المعروف سريريا، المركبات الكهربائية المستمدة من الصفائح الدموية لديها نشاط مضاد للتخثر قوي ^5، في حين تم أظهرت الآخرين للمساهمة في مجموعة واسعة من الشروط، من تعزيز الورم metastaجهاز الأمن والمخابرات ⁶ إلى حماية ضد مرض ^7. ويمكن تصنيف المركبات الكهربائية إلى فئات صغيرة من الحويصلات المشتقة من الخلايا مثل exosomes وmicrovesicles (MVS)، اعتمادا على حجمها وآلية لتوليد ^8. تواصل تسمية المجموعات السكانية الفرعية حويصلة المشتقة من خلية ليكون موضوع النقاش الدائر ^8،9، ومع ذلك، تم وصفها exosomes عموما صغيرة، 40-100 نانومتر الجزيئات المستمدة من الانصهار endosomal مع غشاء البلازما، في حين MVS تكون أكبر من 100 إلى 1،000 الجسيمات نانومتر التي شكلتها سفك غشاء البلازما ^10. هنا، المصطلح العام "السيارات الكهربائية" سوف تستخدم للإشارة إلى جميع أنواع الحويصلات البيولوجية خارج الخلية التي تحررها الخلايا.

عزل المركبات الكهربائية من الدم الكامل هو إجراء متعددة الخطوات، وقد أظهرت العديد من المتغيرات معالجة مختلفة للتأثير على المحتوى EV، بما في ذلك درجة حرارة التخزين ومدة ^11،12، تخثر / حافظة تستخدم ¹³ وتستخدم طريقة الطرد المركزي ^14. وأدى الحاجة إلى توحيد هذه المتغيرات لتوصيات الجمعية الدولية على تخثر الدم والمعالجة وEV العزلة إجراءات تخثر الدم جنة توحيد القياسي (ISTH SSC) لمناسبة العلمية ^و15،16، ولكن هناك عدم وجود إجماع بين الباحثين على بروتوكول الأمثل لاستخدام ^12. معظم توافق، مع ذلك، أن تخضع لرقابة مشددة متغيرات ما قبل التحليلية حاسمة لبيانات دقيقة وقابلة للتكرار.

من أجل تحليل المركبات الكهربائية، واستخدمت الباحثون أساليب مختلفة، بما في ذلك انتقال الإلكترون المجهري ^17، المسح الإلكترون المجهري ^18،19، مجهر القوة الذرية، وعلى ضوء ديناميكية نثر ^20،21 والغربية النشاف ^22،23. في حين FCM هو الأسلوب المفضل لكثير من الباحثين ^{9،24 – 26} نظرا لقدراتها العالية الإنتاجية، وقد تم تحليل المركبات الكهربائية باستخدام FCMمن الصعب المعروف نظرا لحجمها وقلة السكان إيجابي منفصلة ^{27 – 32.} مقارنة تحليل الخلايا، حجم صغير من النتائج المركبات الكهربائية في 1) أقل مضان المنبعثة نتيجة لعدد أقل من المستضدات في الجسيمات و2) الجدوى محدود من الغسيل بعد وصمة عار، وهو أمر ضروري للحد من مضان الخلفية. التحديات المشتركة بين الباحثين وتشمل إشارات الناشئة عن المجاميع المناعي ^27،28 والتجميع الذاتي للأجسام ^29. وعلاوة على ذلك، أوقات المعالجة طويلة ومطولة إجراءات الغسيل / العزلة التي يستخدمها العديد من البروتوكولات الحالية ^33،34 تتطلب التزامات الوقت عدة أيام لتحليل عدد قليل من العينات، مما يجعلها أقل من مثالية لتطبيقات إنتاجية عالية. بعض الباحثين التخلي عن خطوة غسل تماما، مما يجعل المستخدمة تقليديا FCM ضوابط السلبية مثل مضان ناقص واحد (FMO) وisotypes الأجسام المضادة غير مجدية لتقييم بدقة البكالوريامضان kground ^30.

بروتوكولات عنوان لدينا ثلاث مشاكل المشتركة التي يمكن أن تعوق تحليل FCM السليم من المركبات الكهربائية: إشارات الناشئة عن المجاميع الأجسام المضادة وغيرها من غير الحويصلات، صعوبة في إزالة الأجسام المضادة غير منضم، وعدم وجود السكان إيجابي ملحوظ. سوف التقنيات الموضحة هنا مساعدة في القضاء على المجاميع الأجسام المضادة التي توجد عادة في المستحضرات التجارية، وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، ووضع البوابات بطريقة عقلانية أن يقلل من الكشف عن مضان الخلفية. يتم عرض اثنين من طرق الكشف مختلفة هنا: يستخدم البروتوكول الأول لطريقة الكشف الفردية التي هي خاصة مناسبة تماما لتحليل كميات كبيرة من العينات السريرية، في حين يستخدم بروتوكول الثاني النهج القائم على حبات لالتقاط وكشف المركبات الكهربائية الصغيرة وexosomes.

Protocol

ملاحظة: لقد تم تنفيذ البروتوكولات التالية في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية من أجل رفاهية الإنسان. تم اختبار جميع العينات موضوع الإنسان في إطار مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) البروتوكول وافق عليها وللموافقة المسبقة عن موضوع من الموضوعات. </…

Representative Results

ويبين الشكل 1 الخطة الشاملة لعزل وكشف عن المركبات الكهربائية باستخدام إما طريقة القائم على حبة أو طريقة الكشف الفردية المعالجة. كشف الفردية من المركبات الكهربائية باستخدام FCM يعمل بشكل جيد لتحليل المركبات الكهربائية الكبيرة إلا أن معظم cytometers ليست قادرة …

Discussion

وقدمت اثنين من بروتوكولات مختلفة لعزل ومعالجة وتحليل المركبات الكهربائية، وذلك باستخدام إما الكشف الفردي أو النهج القائم على حبة. اختيار أنسب طريقة لاستخدام ليست دائما واضحة ويتطلب فهما للعينة التي يجري اختبارها وكذلك مجموعات سكانية فرعية فردية من الفائدة. وعلاوة …

Materials

LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12×75 polystrene	BD Biosciences	352058
50mL Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips – 10µL	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200µL	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips – 1000µL	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230