טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית שימוש cytometry הזרימה
Summary
שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.
Abstract
תאי שלפוחית (EVS) היא שלפוחית שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.
Introduction
תאי שלפוחית (EVS) היא שלפוחית שנמצאה בנוזלי גוף, כי הם מעורבים מאוד בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים קטנה, המופק מקרום. ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות cytometry זרימה (FCM) כבר קשה לשמצה בשל גודלם הקטן וחוסר אוכלוסיות בדידות חיוביות לסמנים של עניין. שיטות לניתוח EV, תוך שיפור ניכר בעשור האחרון, עדיין בתהליך עבודה. למרבה הצער, אין אף אחד בגודל שמתאים לכל פרוטוקול, וכמה היבטים יש לקחת בחשבון בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. מוצג כאן מספר טכניקות שונות לכלי רכב חשמליים עיבוד ושני פרוטוקולים לניתוח כלי רכב חשמליים או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. השיטות שתוארו כאן יסייע בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, יחס אות לרעש גובר, ושערים הגדרה בf רציונליםashion שממזער גילוי של הקרינה רקע. הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוז כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.
כלי רכב חשמליים, הידוע גם בmicroparticles, הם שלפוחית שנמצאה בנוזלי גוף שמעורבים בתקשורת בין תאים ומסייעים בויסות מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1 קטנה, המופק מקרום. דרך ביטוי של סמנים שונים משטח ו / או העברה ישירה של חומר ביולוגי, כלי רכב חשמליים יכולים לשנות את התפקוד של תאי נמען לשחק או הפעלה או דיכוי תפקידים בתקשורת בין תאית 2-4. כלי רכב חשמליים מבחינה קלינית, platelet-derived ידועים יש פעילות נוגדת קרישה חזקה 5, בעוד שאחרים כבר הוכיחו לתרום למגוון רחב של מצבים, מקידום metasta גידולsis 6 להגנה מפני מחלות 7. כלי רכב חשמליים יכול להיות מסווג לקטגוריות קטנות יותר של שלפוחית שמקורן בתאים כגון exosomes וmicrovesicles (MVS), תלוי בגודל ובמנגנון של דור 8 שלהם. המינוח של תת-אוכלוסיות שלפוחית שמקורן בתאים ממשיך להיות נושא לויכוח מתמשך 8,9, לעומת זאת, exosomes בדרך כלל מתואר כקטנים, 40 עד 100 חלקיקי ננומטר נגזרים מהיתוך endosomal עם קרום הפלזמה, בעוד MVS גדול יותר 100 עד 1,000 חלקיקי ננומטר נוצרו על ידי שפיכה של קרום הפלזמה 10. כאן, המונח הכללי "הרכב החשמלי" ישמש כדי להתייחס לכל הסוגים של שלפוחית ביולוגית תאית שפורסמו על ידי תאים.
בידוד של כלי רכב חשמליים מכל הדם הוא הליך רב-שלבים ומשתני עיבוד רבים ושונים הוכחו משפיעים על תוכן EV, כוללים טמפרטורת אחסון ומשך 11,12, נוגד קרישה / חומר משמר המשמש 13 ושיטת צנטריפוגה משמשת 14. צורך בסטנדרטיזציה של המשתנים הללו הוביל להמלצות על ידי האגודה הבינלאומית על פקקת ותהליכי עיבוד דם ובידוד EV haemostasis מדעיים ותקינת הוועדה (ISTH SSC) לנכון 15,16, עדיין לא קיים הסכמה בין חוקרים על הפרוטוקול האופטימלי להשתמש 12. רובם מסכימים, עם זאת, כי משתנים מראש אנליטיים פיקוח הדוק הם חיוניים לנתונים מדויקים ושחזור.
על מנת לנתח את המכוניות חשמליות, חוקרים נצלו את שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 17, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק 18,19, במיקרוסקופ כוח אטומי, אור דינמי פיזור 20,21 ומערבי סופג 22,23. בעוד FCM הוא שיטת בחירה של חוקרים רבים 9,24 – 26 בשל יכולות התפוקה הגבוהה שלה, ניתוח של כלי רכב חשמליים באמצעות FCM היהקשה לשמצה בשל הגודל וחוסר אוכלוסיות חיוביות בדידות 27 – 32. בהשוואה לניתוח של תאים, גודלו הקטן של כלי הרכב החשמליים בתוצאות 1) הקרינה הנפלטת פחות בשל המספר קטן יותר של אנטיגנים לכל חלקיק ו- 2) ההיתכנות מוגבלת של שטיפת הודעה כתם-, שיש צורך להפחית את קרינת רקע. אתגרים משותפים בין חוקרים כוללים אותות הנובעים מאגרגטים אימונוגלובולין 27,28 וצבירה עצמית של נוגדנים 29. יתר על כן, פעמים העיבוד הארוכות ונהלי כביסה / בידוד ממושכים בשימוש על ידי רב של הפרוטוקולים הנוכחיים 33,34 דורשים התחייבויות זמן רב היום לנתח מספר קטן של דוגמאות, שהופך אותם פחות אידיאלי עבור יישומי תפוקה גבוהים. חלק מהחוקרים לוותר שלב לשטוף לגמרי, טיוח בקרות שליליות FCM משמשים באופן מסורתי כמו מינוס הקרינה אחד (FMO) וisotypes נוגדן חסר תועלת עבור במדויק הערכת Bacהקרינה kground 30.
הפרוטוקולים שלנו מטפל בשלוש בעיות נפוצות שיכול לעכב ניתוח FCM נאות של כלי רכב חשמליים: אותות הנובעים מאגרגטים נוגדן ולא שלפוחית אחרת, קושי בהסרת נוגדן מאוגד, וחוסר אוכלוסיות חיוביות ניכרו. הטכניקות המתוארות כאן יסייעו בביטול מצרפי הנוגדן נמצאים בדרך כלל בהכנות מסחריות, הגדלת יחס אות לרעש, וקביעת שערים בצורה רציונלית שממזערת גילוי של הקרינה רקע. שתי שיטות זיהוי שונות מוצגות כאן: הפרוטוקול הראשון משתמש בשיטת זיהוי אישית שמתאים במיוחד לניתוח נפח גבוה של דגימות קליניות, בעוד שהפרוטוקול השני משתמש בגישה מבוססת חרוזים כדי ללכוד ולזהות כלי רכב חשמליים וexosomes קטנים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
שני פרוטוקולים שונים לבידוד, הטיפול והניתוח של כלי רכב חשמליים הוצגו, תוך שימוש בזיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז. בחירה בשיטה המתאימה ביותר לשימוש היא לא תמיד פשוטה ודורש הבנה של המדגם נבדק, כמו גם תת-האוכלוסיות בודדות של עניין. יתר על כן, את הרגישות של cytometer שימש לרכישה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לדייל הירשקורן מהדם מערכות מכון מחקר על עזרתו עם cytometer זרימת הגדרות מכשיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי HL095470 וHL072268 U01 וחוזי DoD W81XWH-10-1-0023 וW81XWH-2-0028.
Materials
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation–and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -. M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. 암 연구학. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -. F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -. M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
