Der findes mange forskellige metoder til måling af ekstracellulære vesikler (EVS) under anvendelse af flowcytometri (FCM). Flere aspekter bør overvejes, når fastlæggelsen af den mest hensigtsmæssige metode til at bruge. To protokoller for måling elbiler præsenteres, enten ved hjælp af individuelle afsløring eller en perle tilgang.
Ekstracellulær vesikler (EVS) er små, vesikler membran afledt findes i legemsvæsker, der er meget involveret i celle-celle kommunikation og hjælper med at regulere en lang række biologiske processer. Analyse af elbiler ved anvendelse af flowcytometri (FCM) har været notorisk vanskeligt på grund af deres lille størrelse og mangel på diskrete populationer positive for markører af interesse. Metoder til EV analyse mens væsentligt forbedret i det seneste årti, er stadig et arbejde i gang. Desværre er der ingen one-size-fits-all protokol, og flere aspekter skal tages i betragtning ved fastlæggelsen af den mest hensigtsmæssige metode til at bruge. Præsenteret her er flere forskellige teknikker til behandling elbiler og to protokoller til analyse elbiler ved hjælp af enten individuel afsløring eller en perle tilgang. De beskrevne her, vil hjælpe med at fjerne antistof aggregater almindeligvis findes i kommercielle præparater metoder, øget signal-støj-forhold og indstilling porte i en rationel fashion der minimerer detektering af baggrundsfluorescens. Den første protokol benytter en individuel påvisning metode, der er specielt velegnet til at analysere en stor mængde af kliniske prøver, mens den anden protokol bruger en perle tilgang til at indfange og detektere mindre elbiler og exosomer.
Ekstracellulær vesikler (EVS) er små, vesikler membran afledt findes i legemsvæsker, der er meget involveret i celle-celle kommunikation og hjælper med at regulere en lang række biologiske processer. Analyse af elbiler ved anvendelse af flowcytometri (FCM) har været notorisk vanskeligt på grund af deres lille størrelse og mangel på diskrete populationer positive for markører af interesse. Metoder til EV analyse mens væsentligt forbedret i det seneste årti, er stadig et arbejde i gang. Desværre er der ingen one-size-fits-all protokol, og flere aspekter skal tages i betragtning ved fastlæggelsen af den mest hensigtsmæssige metode til at bruge. Præsenteret her er flere forskellige teknikker til behandling elbiler og to protokoller til analyse elbiler ved hjælp af enten individuel afsløring eller en perle tilgang. De beskrevne her, vil hjælpe med at fjerne antistof aggregater almindeligvis findes i kommercielle præparater metoder, øget signal-støj-forhold og indstilling porte i en rationel fashion der minimerer detektering af baggrundsfluorescens. Den første protokol benytter en individuel påvisning metode, der er specielt velegnet til at analysere en stor mængde af kliniske prøver, mens den anden protokol bruger en perle tilgang til at indfange og detektere mindre elbiler og exosomer.
Elbiler, også kendt som mikropartikler, er små, blærer membran-afledte findes i kropsvæsker, der er involveret i celle-celle kommunikation og hjælper med at regulere en bred vifte af biologiske processer 1. Gennem ekspression af forskellige overflademarkører og / eller direkte overførsel af biologisk materiale, elbiler er i stand til at ændre funktionen af recipientceller at spille enten aktivering eller undertrykke roller i intercellulære kommunikation 2 – 4. Klinisk blodpladeafledte EVs er kendt for at have en stærk antikoagulerende aktivitet 5, mens andre har vist sig at bidrage til en lang række betingelser, fra at fremme tumor metastasis 6 til at beskytte mod sygdom 7. Elbiler kan inddeles i mindre grupper af celleafledte vesikler såsom exosomer og mikrovesikler (MVS), afhængig af deres størrelse og mekanisme generation 8. Nomenklaturen af celle-afledt vesikel subpopulationer fortsat et emne af løbende debat 8,9 dog exosomer er generelt beskrevet som små 40 til 100 nm partikler fra endosomal fusion med plasmamembranen, mens MV'er er større 100 til 1.000 nm partikler dannet ved at kaste af plasmamembranen 10. Her vil det generelle udtryk "elbiler" bruges til at henvise til alle typer af ekstracellulære biologiske vesikler frigivet af celler.
Isolering af elbiler fra fuldblod er en multi-trins procedure og mange forskellige behandlinger variabler har vist sig at påvirke EV indhold, herunder opbevaringstemperatur og varighed 11,12, antikoagulant / konserveringsmiddel bruges 13 ogcentrifugering anvendte 14. Et behov for standardisering af disse variabler har ført til anbefalinger fra International Society for Trombose og Hæmostase Videnskabelige og Standardiseringsorganisation (ISTH SSC) for korrekt blod forarbejdning og EV isoleringsfremgangsmåder 15,16, men der eksisterer ingen konsensus blandt forskere om den optimale protokol at bruge 12. De fleste er enige om, dog, at stramt kontrollerede pre-analytiske variabler er afgørende for nøjagtige og reproducerbare data.
For at analysere elbiler, har forskere udnyttet forskellige metoder, herunder transmission elektronmikroskopi 17, scanning elektronmikroskopi 18,19, atomic force mikroskopi, dynamisk lysspredning 20,21 og western blotting 22,23. Mens FCM er den foretrukne metode for mange forskere 9,24 – 26 på grund af dens høje kapacitet kapaciteter, har en analyse af elbiler ved hjælp af FCM væretnotorisk vanskeligt på grund af deres størrelse og mangel på diskrete positive populationer 27-32. Sammenlignet med analyse af celler, at den lille størrelse af EVS resulterer i 1) mindre fluorescens udsendt på grund af det færre antal antigener pr partikel og 2) begrænset mulighederne for post-plet vask, hvilket er nødvendigt reducere baggrundsfluorescens. Fælles udfordringer blandt forskere omfatter signaler skyldes immunglobulinforbindelser 27,28 og selvaggregering af antistoffer 29. Desuden de lange behandlingstider og lange vask / isolation, der benyttes af mange af de nuværende protokoller 33,34 må flere dages tid forpligtelser til at analysere et lille antal prøver, hvilket gør dem mindre end ideelt til høje gennemløb applikationer. Nogle forskere afkald på en vask skridt helt, hvilket gør traditionelt anvendes FCM negative kontroller såsom fluorescens minus én (FMO) og antistofisotyper ubrugelig for præcist at vurdere background fluorescens 30.
Vores protokoller løse tre almindelige problemer, der kan hindre en ordentlig FCM analyse af elbiler: Signaler, der følger af antistof aggregater og andre ikke-vesikler, svært ved at fjerne ubundet antistof, og mangel på mærkbar positive befolkninger. De her beskrevne teknikker vil hjælpe med at fjerne antistof aggregater almindeligvis findes i kommercielle præparater, øget signal-til-støjforhold, og sætte porte på en rationel måde, der minimerer detektering af baggrundsfluorescens. To forskellige detektionsmetoder præsenteres her: den første protokol anvender en individuel påvisning metode, der er specielt velegnet til at analysere en stor mængde af kliniske prøver, mens den anden protokol anvender en perler tilgang til at indfange og detektere mindre elbiler og exosomer.
To forskellige protokoller til isolering, behandling og analyse af elbiler blev præsenteret, under anvendelse af enten en enkelt detektering eller perle tilgang. Valg den mest hensigtsmæssige metode at bruge, er ikke altid ligetil og kræver en forståelse af den prøve, der testes, samt de individuelle subpopulationer af interesse. Desuden skal følsomheden af cytometeret anvendes til erhvervelse overvejes, når du vælger den mest hensigtsmæssige metode. Ofte er der ingen enkelt bedste protokol til at bruge, …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dale Hirschkorn fra Blood Systems Research Institute for hans hjælp med flowcytometer instrumentindstillinger. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud HL095470 og U01 HL072268 og DoD kontrakter W81XWH-10-1-0023 og W81XWH-2-0028.
LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
PANEL I | |||
CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
PANEL II | |||
CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
PANEL III | |||
CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |