Många olika metoder finns för mätning av extracellulära vesiklar (EVT) med användning av flödescytometri (FCM). Flera aspekter bör beaktas vid fastställandet av den lämpligaste metoden att använda. Två protokoll för mätning elbilar presenteras, antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt.
Extracellulär Blåsor (EVS) är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är mycket engagerade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer. Analys av elbilar använder flödescytometri (FCM) har varit notoriskt svårt på grund av sin ringa storlek och brist på diskreta populationer positiva för markörer av intresse. Metoder för EV analys, medan betydligt förbättrats under det senaste årtiondet, är fortfarande ett pågående arbete. Tyvärr, det finns ingen one-size-fits-all protokoll, och flera aspekter måste beaktas vid bestämning av lämpligaste metoden att använda. Presenteras här finns flera olika tekniker för bearbetning elbilar och två protokoll för att analysera elbilar använder antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanliga i kommersiella beredningar, ökar signal-brusförhållande, och inställningsgrindar i en rationell fashion som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder en pärla baserad metod för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.
Extracellulär Blåsor (EVS) är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är mycket engagerade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer. Analys av elbilar använder flödescytometri (FCM) har varit notoriskt svårt på grund av sin ringa storlek och brist på diskreta populationer positiva för markörer av intresse. Metoder för EV analys, medan betydligt förbättrats under det senaste årtiondet, är fortfarande ett pågående arbete. Tyvärr, det finns ingen one-size-fits-all protokoll, och flera aspekter måste beaktas vid bestämning av lämpligaste metoden att använda. Presenteras här finns flera olika tekniker för bearbetning elbilar och två protokoll för att analysera elbilar använder antingen enskilt upptäckt eller en pärla baserat tillvägagångssätt. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanliga i kommersiella beredningar, ökar signal-brusförhållande, och inställningsgrindar i en rationell fashion som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder en pärla baserad metod för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.
Elbilar, även känd som mikropartiklar, är små, membran härledda vesiklar som finns i kroppsvätskor som är involverade i cell-cellkommunikation och hjälper till att reglera ett varierat utbud av biologiska processer 1. Genom uttryck av olika ytmarkörer och / eller direkt överföring av biologiskt material, elbilar kan ändra funktionen hos mottagarceller för att spela antingen aktivera eller undertrycka roller i kommunikationen mellan 2-4. Kliniskt, elbilar trombocytrelaterade är kända för att ha en stark antikoagulerande aktivitet 5, medan andra har visat sig bidra till ett brett spektrum av förhållanden, från att främja tumör metastasis 6 att skydda mot sjukdomar 7. Elbilar kan delas in i mindre grupper av celler erhållna vesiklar såsom exosomes och mikrovesiklar (MV), beroende på deras storlek och mekanismen för generering 8. Nomenklaturen för-cellerna vesikler subpopulationer fortsätter att vara ett ämne för pågående debatten 8,9 dock exosomes generellt beskrivs som små, 40 till 100 nm partiklar härrörande från endosomal fusion med plasmamembranet, medan MV är större 100 till 1.000 nm partiklar som bildas genom att kasta av plasmamembranet 10. Här kommer den allmänna termen "elbilar" användas för att hänvisa till alla typer av extracellulära biologiska vesiklar släpptes av celler.
Isolering av elbilar från helblod är ett förfarande i flera steg och många olika behandlingsvariabler har visats påverka EV innehåll, inklusive lagringstemperatur och varaktighet 11,12, antikoagulantia / konserveringsmedel som används 13 ochcentrifuge metod som används 14. Ett behov av standardisering av dessa variabler har lett till rekommendationer från International Society om Thrombosis and Haemostasis Vetenskapliga och standardiseringskommitté (ISTH SSC) för korrekt bearbetning blod och EV isoleringsförfaranden 15,16, men det finns ingen enighet bland forskare om den optimala protokollet att använda 12. De flesta är dock överens om att hårt kontrollerade pre-analytiska variabler är avgörande för exakta och reproducerbara data.
För att analysera elbilar, har forskarna utnyttjat olika metoder, inklusive transmissionselektronmikroskopi 17, svepelektronmikroskopi 18,19, atomkraftsmikroskopi, dynamisk ljusspridning 20,21 och western blotting 22,23. Medan FCM är metoden för många forskare 9,24 – 26 på grund av dess höga genomströmning kapacitet, har analyser av elbilar använder FCM varitnotoriskt svårt på grund av sin storlek och brist på diskreta positiva befolknings 27-32. Jämfört med analys av celler, till den lilla storleken hos EVS resulterar i en) mindre fluorescens som emitteras på grund av det färre antal antigen per partikel och 2) begränsad genomförbarhet av post-fläck tvättning, vilket är nödvändigt minska bakgrundsfluorescens. Gemensamma utmaningar bland forskare inkluderar signaler som härrör från immunglobulinaggregat 27,28 och själv aggregering av antikroppar 29. Dessutom de långa handläggningstider och långa tvätt / isoleringsförfaranden som används av många av de nuvarande protokollen 33,34 kräver flerdagars tid åtaganden för att analysera ett litet antal prover, vilket gör dem mindre än idealisk för hög genomströmning applikationer. Vissa forskare avstå ett tvättsteg helt och hållet, vilket gör traditionellt används FCM negativa kontroller såsom fluorescens minus ett (FMO) och antikroppsisotyper värdelös för exakt bedöma background fluorescens 30.
Våra protokoll upp tre vanliga problem som kan hindra ett korrekt FCM analys av elbilar: signaler som härrör från aggregat antikropps och andra icke-vesikler, svårt att ta bort obunden antikropp, och brist på både positiva befolkningar. De tekniker som beskrivs här kommer att hjälpa till med att eliminera de aggregat antikropps vanligen återfinns i kommersiella preparat, ökar signal-till-brusförhållande, och att sätta grindar på ett rationellt sätt som minimerar detektering av bakgrundsfluorescens. Två olika detektionsmetoder presenteras här: den första protokollet använder en individuell detektionsmetod som är särskilt väl lämpad för att analysera en stor mängd kliniska prover, medan den andra protokollet använder ett pärlor baserad strategi för att fånga och upptäcka mindre elbilar och exosomes.
Två olika protokoll för isolering, behandling och analys av elbilar presenterades, med antingen en individuell detektering eller pärla baserat synsätt. Välja den lämpligaste metoden att använda är inte alltid enkelt och kräver en förståelse av provet som testas samt individuella subpopulationer av intresse. Dessutom måste känslighet cytometern används för förvärv beaktas när man väljer den lämpligaste metoden. Ofta finns det inget enskilt bästa protokoll som ska användas, snarare en kombination av …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dale Hirschkorn från Blood Systems Research Institute för hans hjälp med flödescytometer instrumentinställningar. Detta arbete stöddes av NIH bidrag HL095470 och U01 HL072268 och DoD kontrakt W81XWH-10-1-0023 och W81XWH-2-0028.
LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
PANEL I | |||
CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
PANEL II | |||
CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
PANEL III | |||
CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |