Mange forskjellige fremgangsmåter eksisterer for måling av ekstracellulære vesikler (kjøretøyer) ved hjelp av strømningscytometri (FCM). Flere aspekter bør vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. To protokoller for måle elbiler presenteres, enten ved hjelp av individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming.
Ekstracellulære Blemmer (elbiler) er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er svært involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser. Analyse av elbiler bruker flowcytometri (FCM) har vært notorisk vanskelig på grunn av sin lille størrelse og mangel på diskrete populasjoner positive for markører av interesse. Metoder for EV analyse, mens betydelig forbedret de siste ti årene, er fortsatt et arbeid som pågår. Dessverre, det er ingen one-size-fits-all-protokollen, og flere aspekter må vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. Presenteres her er flere forskjellige teknikker for behandling elbiler og to protokoller for å analysere elbiler ved hjelp av enten individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming. Metodene som beskrives her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater som vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og innstillings portene i en rasjonell fashion som minimerer påvisning av bakgrunnen fluorescens. Den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perle basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.
Ekstracellulære Blemmer (elbiler) er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er svært involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser. Analyse av elbiler bruker flowcytometri (FCM) har vært notorisk vanskelig på grunn av sin lille størrelse og mangel på diskrete populasjoner positive for markører av interesse. Metoder for EV analyse, mens betydelig forbedret de siste ti årene, er fortsatt et arbeid som pågår. Dessverre, det er ingen one-size-fits-all-protokollen, og flere aspekter må vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. Presenteres her er flere forskjellige teknikker for behandling elbiler og to protokoller for å analysere elbiler ved hjelp av enten individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming. Metodene som beskrives her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater som vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og innstillings portene i en rasjonell fashion som minimerer påvisning av bakgrunnen fluorescens. Den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perle basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.
Elbiler, også kjent som mikropartikler, er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser 1. Ved ekspresjon av forskjellige overflatemarkører og / eller direkte overføring av biologisk materiale, EV er i stand til å endre funksjonen av mottakercellene til å spille enten aktivere eller undertrykke roller i intercellulær kommunikasjon 2 – 4. Klinisk platederivert EV er kjent for å ha sterk antikoagulerende aktivitet 5, mens andre har vist seg å bidra til et bredt spekter av tilstander, fra å fremme tumor metastasis 6 til å beskytte mot sykdom 7. Elbiler kan klassifiseres i mindre kategorier av celle-stammer vesikler som exosomes og mikrovesikler (MV), avhengig av størrelse og mekanisme generasjon 8. Nomenklaturen av celle-avledet vesikkel subpopulasjoner fortsetter å være et emne for debatt 8,9, men exosomes er generelt beskrevet som små, 40 til 100 nm-partikler avledet fra endosomale fusjon med plasmamembranen, mens MV er større 100 til 1000 nm partikler dannet ved utstøtingen av plasmamembranen 10. Her vil den generelle termen "elbiler" brukes til å referere til alle typer ekstracellulære biologiske vesikler utgitt av celler.
Isolering av el-biler fra helblod er en flertrinns fremgangsmåte og mange forskjellige prosessvariable har vist seg å påvirke EV innhold, inkludert lagringstemperatur og varighet 11,12, antikoagulant / konserveringsmiddel som brukes, og 13sentrifugeringsmetoden brukes 14. Et behov for standardisering av disse variablene har ført til anbefalinger fra International Society på Trombose og Haemostasis Vitenskapelige og Standardisering Committee (ISTH SSC) for skikkelig blod prosessering og EV isolasjonsprosedyrer 15,16, men det finnes ingen enighet blant forskere om den optimale protokollen å bruke 12. De fleste er imidlertid enige om at tett kontrollert pre-analytiske variabler er avgjørende for nøyaktige og reproduserbare data.
For å analysere elektriske biler, har forskere benyttet forskjellige metoder, inkludert transmisjonselektronmikroskopi 17, scanning elektronmikroskopi 18,19, atomkraftmikroskopi, dynamisk lysspredning 20,21 og western-blotting 22,23. Mens FCM er metoden for valg for mange forskere 9,24 – 26 på grunn av sin store gjennomgangs evner, har analyse av elbiler bruker FCM værtnotorisk vanskelig på grunn av deres størrelse og mangel på adskilte positive populasjoner 27-32. Sammenlignet med analyser av celler, til den lille størrelsen av EVS resulterer i 1) mindre fluorescens avgitt på grunn av det mindre antall antigener per partikkel og 2) begrenset muligheten for post-flekk vasking, noe som er nødvendig for å redusere bakgrunnsfluorescens. Felles utfordringer blant forskere inkluderer signaler som kommer fra immunglobulinaggregater 27,28 og selv aggregering av antistoffer 29. Videre er lang saksbehandlingstid og lange vask / isolering prosedyrer som brukes av mange av de aktuelle protokollene 33,34 krever multi-dagers tid forpliktelser til å analysere et lite antall prøver, noe som gjør dem mindre enn ideell for programmer med høy gjennomstrømning. Noen forskere avkall en vasketrinn helt, rende tradisjonelt brukt FCM negative kontroller som fluorescens minus én (FMO) og antistoffisotypene ubrukelig for nøyaktig vurdering av background fluorescens 30.
Våre protokoller adressere tre vanlige problemer som kan hemme riktig FCM analyse av elbiler: signaler som oppstår ved antistoff aggregater og andre ikke-blemmer, vanskeligheter med å fjerne ubundet antistoff, og mangel på bare positive populasjoner. De teknikker som er beskrevet her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og å sette portene på en rasjonell måte som minimerer påvisning av bakgrunnsfluorescens. To forskjellige deteksjonsmetoder presenteres her: den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perler basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.
To forskjellige protokoller for isolering, behandling og analyse av elbiler ble presentert, ved hjelp av enten en enkeltperson påvisning eller perle basert tilnærming. Velge den mest hensiktsmessige metoden å bruke er ikke alltid enkel og krever en forståelse av prøven blir testet samt de enkelte subpopulasjoner av interesse. Videre må følsomheten av cytometer som brukes for anskaffelse tas i betraktning ved valg av den mest hensiktsmessige metode. Ofte er det ingen enkelt beste protokoll som brukes, snarere en k…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Dale Hirschkorn fra Blood Systems Research Institute for hans hjelp med strømningscytometer instrumentinnstillinger. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd HL095470 og U01 HL072268 og DoD kontrakter W81XWH-10-1-0023 og W81XWH-2-0028.
LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red) | |
FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
Facs tubes 12×75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
50mL Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
Green-Pak pipet tips – 10µL | Rainin | GP-L10S | |
Green-Pak pipet tips -200µL | Rainin | GP-L250S | |
Green -Pak pipet tips – 1000µL | Rainin | GP-L1000S | |
Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
PANEL I | |||
CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
PANEL II | |||
CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
PANEL III | |||
CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |