Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Summary

Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis. Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório. Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados.

Abstract

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo gram-positivo que é capaz de causar infecções invasivas graves em pacientes imunocomprometidos, idosos e gestantes. As manifestações mais comuns de listeriose em humanos incluem meningite, encefalite e aborto fetal. Uma sequência significativa, mas muito menos documentada de infecção invasiva de L. monocytogenes envolve o coração. A taxa de mortalidade por doença cardíaca pode ser de até 35% apesar do tratamento, porém muito pouco se sabe sobre a colonização de L. monocytogenes de tecido cardíaco e suas patologias resultantes. Além disso, tornou-se recentemente evidente que as subpopulações de L. monocytogenes têm uma capacidade aumentada de invadir e crescer dentro do tecido cardíaco. Este protocolo descreve em detalhes métodos in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o cardiotropismo de L. monocytogenes isolados. Métodos são apresentados para a infecção de míbios cardíacos de rato H9c2 na cultura tecidual, bem como para a determinação da colonização bacteriana dos corações dos camundongos infectados. Esses métodos são úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também podem facilitar a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão de células cardíacas e/ou promover alterações na patologia cardíaca. Esses métodos também preveem a comparação direta do cardiotropismo entre múltiplas cepas de L. monocytogenes.

Introduction

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular gram-positivo capaz de causar doenças graves em populações suscetíveis, incluindo idosos, gestantes, pessoas com HIV/AIDS e pessoas que recebem quimioterapia¹. A infecção nessas populações é frequentemente resultado da ingestão de produtos alimentares contaminados, e a maioria das infecções estão associadas a surtos de alimentos em larga escala^2,3. Em humanos e outros mamíferos, L. monocytogenes é capaz de translocar através da fronteira epitelial do intestino delgado, sendo posteriormente transportado para o fígado^4,5. Modelos animais sugerem que as bactérias ingeridas se replicam dentro do villi intestinal e transitam para o fígado através da veia portal ou se espalham através dos linfonodos mesentéricos na corrente sanguínea, levando à disseminação hematógena no fígado e ao baço^6,7. No fígado e no baço, a bactéria é capaz de mediar a absorção tanto em fagocitos profissionais quanto em células parenchímicas residentes, e rapidamente estabelece infecções dentro desses órgãos. À medida que a carga bacteriana aumenta, inúmeras bactérias são dispersas de volta ao sangue, onde são capazes de colonizar ainda mais tecidos suscetíveis, incluindo o sistema nervoso central e a placenta (onde estão presentes). A colonização desses locais impede manifestações mais comuns de listeriose em humanos, incluindo meningite, encefalite e aborto fetal².

Subpopulações selecionadas de L. monocytogenes têm sido recentemente mostrados com uma capacidade aprimorada de invadir e replicar dentro do tecido cardíaco⁸. As manifestações de envolvimento cardíaco são variadas, e vão desde endocardite e pericárite, até miocardite fulminante completa com anormalidades de condução^9-13. O número total de casos cardíacos de L. monocytogenes por ano é baixo, mas pode ser subestimado, pois essa faceta de infecção não é geralmente bem reconhecida. A colonização do coração por patógenos muitas vezes requer predisposições hospedeiras, como danos valvulares pré-existentes ou válvulas cardíacas artificiais. Há, no entanto, isolados de L. monocytogenes que foram identificados que são notáveis por sua capacidade de colonizar os corações dos animais infectados na ausência de qualquer dano cardíaco e/ou anormalidades⁸.

Aqui são descritos métodos in vitro e in vivo para avaliar a colonização bacteriana do tecido cardíaco dentro de animais infectados usando ensaios de invasão na cultura tecidual, bem como infecções animais vivos. Esses métodos têm se mostrado úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também devem ser úteis para a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão celular cardíaca e/ou resultar em alterações na patologia cardíaca. Esses métodos facilitam a comparação do cardiotropismo entre múltiplas cepas. Para os métodos aqui descritos, l. monocytogenes 10403S é usado como um representante bem estudado de uma cepa não cardiotrópica e o isolado clínico 07PF0776 é usado como um exemplo representativo de uma cepa cardiotrópica. Essas duas cepas foram escolhidas para fornecer uma comparação para a invasão bacteriana de células cardíacas in vitro e colonização de corações de camundongos infectados in vivo. O isolado 07PF0776 é um isolado clínico recuperado de um abscesso interventricular que causou uma arritmia fatal em um paciente HIV+⁸. L. os isolados de monocytogenes podem variar em seu potencial de virulência, e dada a propensão para listeria infectar pessoas com imunossupressão e gestantes, as pessoas dentro dessas populações devem ter cuidado ao avaliar diferentes isolados clínicos.

Protocol

1. Condições de armazenamento e cultura para cepas de l. monocytogenes Prepare a mídia sólida autoclavando o ágar de infusão cérebro-coração (BHI) e despejando a mídia derretida em placas de petri. Deixe as placas secarem durante a noite à temperatura ambiente, depois durante a noite novamente a 37 °C. Usando um laço estéril, obtenha uma pequena amostra de L. monocytogenes de estoques congeladores previamente feitos (bactérias suspensas em 20% de glicerol em mídia l?…

Representative Results

Isolados selecionados de L. monocytogenes exibem maior invasão de células cardíacas na cultura celular e em modelos de infecção de camundongos. A Figura 1 mostra um exemplo de como as colônias bacterianas podem aparecer após o revestimento de suspensões na mídia ágar. Este método permite uma avaliação precisa das CFUs dentro de uma amostra sem o uso de um grande número de placas de mídia ágar. A Figura 2 mostra um exemplo de um ensaio baseado em cultura tecidual …

Discussion

L. monocytogenes é um patógeno humano generalizado e bem caracterizado, capaz de causar uma série de manifestações diferentes da doença¹⁵. A bactéria foi descrita anteriormente por sua capacidade de translocar através de barreiras, como a barreira hematoencefálica e as barreiras placentárias-fetais, a fim de alcançar e colonizar o sistema nervoso central e desenvolver feto, respectivamente. A capacidade in vivo do organismo de colonizar esses tecidos é muitas vezes complementada p…

Materials

Difco	BHI Broth Base	237200	2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2KG of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14mL Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75cm^2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum