Оценка бактериального вторжения сердечных клеток в культуре и колонизации сердца у инфицированных мышей с использованием листерий моноцитогенов

Summary

Листерии моноцитогенов вызывает инфекции плода у беременных женщин и менингит в восприимчивых популяциях. Субпопуляции бактерий могут колонизировать сердечную ткань, вызывая миокардит у пациентов и лабораторных животных. Здесь мы представляем протокол, который описывает, как оценить L. monocytogenes сердечной клетки вторжения в пробирке и сердечной колонизации у инфицированных животных.

Abstract

Listeria monocytogenes является грамположительным внутриклеточным патогеном, который способен вызывать серьезные инвазивные инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, пожилых людей и беременных женщин. Наиболее распространенными проявлениями листериоза у людей являются менингит, энцефалит и аборты плода. Значительное, но гораздо менее документально продолжение инвазивных L. monocytogenes инфекции включает в себя сердце. Уровень смертности от сердечно-сосудистых заболеваний может быть до 35%, несмотря на лечение, однако очень мало известно о L. monocytogenes колонизации сердечной ткани и ее результатных патологий. Кроме того, в последнее время стало очевидно, что субпопуляции L. monocytogenes имеют повышенную способность вторгаться и расти в сердечной ткани. Этот протокол подробно описывает в пробирке и in vivo методы, которые могут быть использованы для оценки кардиотропизма Изолятов L. monocytogenes. Представлены методы заражения крысиных миобластов H9c2 в культуре тканей, а также для определения бактериальной колонизации сердец инфицированных мышей. Эти методы полезны не только для выявления штаммов с потенциалом колонизации сердечной ткани у инфицированных животных, но также могут способствовать выявлению бактериальных генных продуктов, которые служат для повышения вторжения сердечной клетки и / или диск изменения в патологии сердца. Эти методы также обеспечивают прямое сравнение кардиотропизма между несколькими штаммами L. monocytogenes.

Introduction

Листерия моноцитогенов является грамположительных внутриклеточных патогенов, способных вызвать тяжелые заболевания в восприимчивых групп населения, в том числе пожилых людей, беременных женщин, людей с ВИЧ / СПИДом, и лиц, получающих^{химиотерапию 1}. Инфекция в этих популяциях часто является результатом еды загрязненных пищевых продуктов, и большинство инфекций связаны с крупномасштабными вспышками^{пищевого происхождения 2,3}. У людей и других млекопитающих, L. monocytogenes способен транслокации через эпителианую границу тонкой кишки, после чего транспортируется в^{печень 4,5}. Модели животных предполагают, что попадает бактерий репликации в кишечном вилли и транзита в печень через портал вены или распространяется через мезентериотических лимфатических узлов в кровоток, что приводит к гематогенного распространения в печени и^{селезенки 6,7}. В печени и селезенке бактерия способна опоясыть поглощение как в профессиональные фагоциты, так и в резидентные паренхимальные клетки, и быстро устанавливает инфекции в этих органах. По мере увеличения бактериальной нагрузки, многочисленные бактерии рассредоточены обратно в кровь, где они способны дальнейшей колонизации восприимчивых тканей, включая центральную нервную систему и плаценту (где присутствует). Колонизация этих участков исключает наиболее распространенные проявления листериоза у людей, включая менингит, энцефалит и аборт плода^2.

Выбранные субпопуляции L. monocytogenes были недавно показано, что повышенная способность вторгаться и размножаться в сердечной ткани⁸. Проявления сердечного вмешательства разнообразны, и варьируются от эндокардита и перикардита, до фульминантного миокардита в комплекте с^{нарушениями проводимости 9-13}. Общее число случаев сердечного заболевания L. monocytogenes в год является низким, но может быть меньше, так как этот аспект инфекции, как правило, не хорошо признается. Колонизация сердца патогенными микроорганизмами часто требует предрасположенности хозяина, такой как уже существующие клапанные повреждения или искусственные клапаны сердца. Есть, однако, изоляты L. monocytogenes, которые были определены, которые отличаются своей способностью колонизировать сердца инфицированных животных при отсутствии каких-либо сердечных повреждений и / или^{аномалий 8}.

В этом описаны методы in vitro и in vivo для оценки бактериальной колонизации сердечной ткани у инфицированных животных с использованием нашествия анализов в культуре тканей, а также инфекций живых животных. Эти методы оказались полезными не только для выявления штаммов с потенциалом колонизации сердечной ткани у инфицированных животных, но также должны быть полезны для выявления бактериальных генных продуктов, которые служат для повышения вторжения сердечной клетки и / или привести к изменениям в патологии сердца. Эти методы облегчают сравнение кардиотропизма между несколькими штаммами. Для описанных здесь методов L. monocytogenes 10403S используется в качестве хорошо изученного представителя недиотропного штамма, а клинический изолят 07PF0776 используется в качестве репрезентативного примера кардиотропного штамма. Эти два штамма были выбраны для обеспечения сравнения для бактериального вторжения сердечных клеток в пробирке и колонизации сердца инфицированных мышей in vivo. Изолят 07PF0776 является клиническим изолятом, восстановленным после промежуточного абсцесса, который вызвал смертельную аритмию у ВИЧ-инфицированного^{пациента 8}. L. monocytogenes изолирует может варьироваться в их вирулентности потенциал, и, учитывая склонность к Listeria заразить людей с иммуносупрессией и беременных женщин, лица в этих популяциях должны проявлять осторожность при оценке различных клинических изолятов.

Protocol

1. Условия хранения и культуры для штаммов L. monocytogenes Подготовь твердые средства путем autoclaving агар вливания мозга-сердца (BHI) и заливки расплавленных средств в плиты Петри. Разрешить пластины высохнуть на ночь при комнатной температуре, а затем снова на ночь при температуре 37 гр?…

Representative Results

Выбранные изоляты L. monocytogenes демонстрируют усиленное вторжение сердечных клеток в клеточной культуре и в мышиных моделях инфекции. Рисунок 1 показывает пример того, как бактериальные колонии могут появиться после точечного покрытия суспензий на агар-медиа. Этот метод поз?…

Discussion

L. monocytogenes является широко распространенным и хорошо охарактеризованным патогеном человека, способным вызывать ряд различных проявлений заболевания^15. Бактерия была ранее описана за его способность транслокировать через барьеры, такие как гемовно-мозговой барьер и плацента…

Materials

Difco	BHI Broth Base	237200	2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2KG of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14mL Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75cm^2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum