Beoordeling van bacteriële invasie van hartcellen in cultuur en hartkolonisatie bij geïnfecteerde muizen met listeria monocytogenes
Summary
Listeria monocytogenes veroorzaakt foetale infecties bij zwangere vrouwen en meningitis bij gevoelige populaties. Subpopulaties van bacteriën kunnen hartweefsel koloniseren, waardoor myocarditis ontstaat bij patiënten en proefdieren. Hier presenteren we een protocol dat beschrijft hoe L. monocytogenes cardiale celinvasie in vitro en cardiale kolonisatie bij geïnfecteerde dieren te beoordelen.
Abstract
Listeria monocytogenes is een grampositieve facultatieve intracellulaire ziekteverwekker die ernstige invasieve infecties kan veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten, ouderen en zwangere vrouwen. De meest voorkomende manifestaties van listeriose bij mensen zijn meningitis, encefalitis en foetale abortus. Een significant maar veel minder gedocumenteerd vervolg op invasieve L. monocytogenes infectie betreft het hart. Het sterftecijfer door hartaandoeningen kan oplopen tot 35% ondanks de behandeling, maar er is zeer weinig bekend over L. monocytogenes kolonisatie van hartweefsel en de daaruit voortvloeiende pathologieën. Bovendien is onlangs duidelijk geworden dat subpopulaties van L. monocytogenes een verbeterd vermogen hebben om binnen te dringen en te groeien in hartweefsel. Dit protocol beschrijft in detail in vitro en in vivo methoden die kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van cardiotropisme van L. monocytogenes isolaten. Methoden worden gepresenteerd voor de infectie van H9c2-hartstilstandstheoblasten bij ratten in weefselkweek en voor de bepaling van bacteriële kolonisatie van de harten van geïnfecteerde muizen. Deze methoden zijn niet alleen nuttig voor het identificeren van stammen met het potentieel om hartweefsel bij geïnfecteerde dieren te koloniseren, maar kunnen ook de identificatie van bacteriële genproducten vergemakkelijken die dienen om hartcelinvasie te verbeteren en / of veranderingen in hartpathologie te stimuleren. Deze methoden voorzien ook in de directe vergelijking van cardiotropisme tussen meerdere L. monocytogenes stammen.
Introduction
Listeria monocytogenes is een grampositieve intracellulaire ziekteverwekker die ernstige ziekten kan veroorzaken bij gevoelige populaties, waaronder ouderen, zwangere vrouwen, mensen met HIV/AIDS en personen die chemotherapiekrijgen 1. Infectie in deze populaties is vaak het gevolg van het innemen van besmette voedingsmiddelen, en de meeste infecties worden geassocieerd met grootschalige door voedsel overgedragen uitbraken2,3. Bij mensen en andere zoogdieren is L. monocytogenes in staat om zich over de epitheelrand van de dunne darm te verplaatsen en vervolgens naar de lever te worden getransporteerd4,5. Diermodellen suggereren dat ingeslikte bacteriën zich repliceren in de intestinale villi en via de poortader naar de lever gaan of zich via de mesenterische lymfeklieren in de bloedstroom verspreiden, wat leidt tot hematogene verspreiding naar de lever en milt6,7. In de lever en milt is de bacterie in staat om de opname in zowel professionele fagocyten als inwonende parenchymale cellen te bemiddelen en stelt snel infecties in deze organen vast. Naarmate de bacteriële belasting toeneemt, worden tal van bacteriën teruggespreid in het bloed, waar ze in staat zijn om gevoelige weefsels verder te koloniseren, waaronder het centrale zenuwstelsel en de placenta (indien aanwezig). Kolonisatie van deze sites sluit de meest voorkomende manifestaties van listeriose bij mensen uit, waaronder meningitis, encefalitis en foetale abortus2.
Van geselecteerde subpopulaties van L. monocytogenes is onlangs aangetoond dat ze een verbeterd vermogen hebben om binnen te dringen en zich te repliceren in hartweefsel8. Manifestaties van hartbetrokkenheid zijn gevarieerd en variëren van endocarditis en pericarditis tot fulminante myocarditis compleet met geleidingsafwijkingen9-13. Het totale aantal L. monocytogenes cardiale gevallen per jaar is laag, maar kan onder schatting zijn omdat dit facet van infectie niet algemeen goed wordt herkend. Kolonisatie van het hart door ziekteverwekkers vereist vaak gastheerpredisposities zoals reeds bestaande valvulaire schade of kunstmatige hartkleppen. Er zijn echter isolaten van L. monocytogenes geïdentificeerd die opmerkelijk zijn vanwege hun vermogen om de harten van geïnfecteerde dieren te koloniseren bij afwezigheid van hartschade en/of afwijkingen8.
Hierin worden in vitro en in vivo methoden beschreven voor het beoordelen van bacteriële kolonisatie van hartweefsel bij geïnfecteerde dieren met behulp van invasietesten in weefselkweek en levende dierinfecties. Deze methoden zijn niet alleen nuttig gebleken voor het identificeren van stammen met het potentieel om hartweefsel bij geïnfecteerde dieren te koloniseren, maar moeten ook nuttig zijn voor de identificatie van bacteriële genproducten die dienen om hartcelinvasie te verbeteren en / of te resulteren in veranderingen in hartpathologie. Deze methoden vergemakkelijken de vergelijking van cardiotropisme tussen meerdere stammen. Voor de hier beschreven methoden wordt L. monocytogenes 10403S gebruikt als een goed bestudeerde vertegenwoordiger van een niet-cardiotrope stam en wordt het klinische isolaat 07PF0776 gebruikt als een representatief voorbeeld van een cardiotrope stam. Deze twee stammen werden gekozen om een vergelijking te bieden voor bacteriële invasie van hartcellen in vitro en kolonisatie van harten van geïnfecteerde muizen in vivo. Het isolaat 07PF0776 is een klinisch isolaat dat is hersteld van een interventratriculair abces dat een fatale aritmie veroorzaakte bij een HIV+ patiënt8. L. monocytogenes isolaten kunnen variëren in hun virulentiepotentieel, en gezien de neiging voor Listeria om personen met immunosuppressie en zwangere vrouwen te infecteren, moeten personen binnen deze populaties voorzichtig zijn bij het beoordelen van verschillende klinische isolaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes is een wijdverspreide en goed gekarakteriseerde menselijke ziekteverwekker, die in staat is om een aantal verschillende ziektemanifestaties te veroorzaken15. De bacterie is eerder beschreven voor zijn vermogen om over barrières, zoals de bloed -hersenbarrière en placenta-foetale barrières, om respectievelijk het centrale zenuwstelsel te bereiken en te koloniseren en foetus te ontwikkelen. Het in vivo vermogen van het organisme om deze weefsels te koloniseren wordt vaak aan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Public Health Service AI41816 en AI099339 (N.E.F.) en door F31AI094886-01 (P.D.M.) van NIAID. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financieringsbronnen.
Materials
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2KG of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14mL Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75cm^2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5mL microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
References
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
- Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
- Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
- Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
- Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
- Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
- Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
- Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
- Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
- Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
- Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
- McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
- Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
- Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
- Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
- Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
- McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).
