Évaluation de l’invasion bactérienne des cellules cardiaques en culture et colonisation cardiaque chez des souris infectées à l’aide de Listeria monocytogenes

Summary

Listeria monocytogenes cause des infections fœtales chez les femmes enceintes et une méningite dans les populations sensibles. Les sous-populations de bactéries peuvent coloniser le tissu cardiaque, provoquant une myocardite chez les patients et les animaux de laboratoire. Ici nous présentons un protocole qui décrit comment évaluer l’invasion de cellules cardiaques de monocytogenes de L. in vitro et la colonisation cardiaque chez les animaux infectés.

Abstract

Listeria monocytogenes est un agent pathogène intracellulaire facultatif à Gram positif capable de causer des infections invasives graves chez les patients immunodéprimés, les personnes âgées et les femmes enceintes. Les manifestations les plus communes de la listériose chez l’homme incluent la méningite, l’encéphalite, et l’avortement foetal. Une conséquence significative mais beaucoup moins documentée de l’infection invahissante de monocytogenes de L. implique le coeur. Le taux de mortalité par maladie cardiaque peut aller jusqu’à 35% malgré le traitement, mais on sait très peu de choses concernant la colonisation du tissu cardiaque par L. monocytogenes et ses pathologies qui en résultent. De plus, il est récemment devenu évident que les sous-populations de L. monocytogenes ont une capacité accrue d’envahir et de croître dans le tissu cardiaque. Ce protocole décrit en détail les méthodes in vitro et in vivo qui peuvent être employées pour évaluer le cardiotropism des isolats de monocytogenes de L. Des méthodes sont présentées pour l’infection des myoblastes cardiaques de rat H9c2 dans la culture de tissu ainsi que pour la détermination de la colonisation bactérienne des coeurs des souris infectées. Ces méthodes sont utiles non seulement pour identifier les souches susceptibles de coloniser le tissu cardiaque chez les animaux infectés, mais peuvent également faciliter l’identification de produits génétiques bactériens qui servent à améliorer l’invasion cellulaire cardiaque et /ou à entraîner des changements dans la pathologie cardiaque. Ces méthodes prévoient également la comparaison directe du cardiotropisme entre plusieurs souches de L. monocytogenes.

Introduction

Listeria monocytogenes est un agent pathogène intracellulaire à Gram positif capable de causer une maladie grave dans les populations réceptives, y compris les personnes âgées, les femmes enceintes, les personnes vivant avec le VIH/sida et les personnes recevant une chimiothérapie¹. L’infection dans ces populations est souvent le résultat de l’ingestion de produits alimentaires contaminés, et la plupart des infections sont associées à des éclosions d’origine alimentaire à grande échelle^2,3. Chez l’homme et d’autres mammifères, L. monocytogenes est capable de se déplacer à travers la bordure épithéliale de l’intestin grêle, puis d’être transporté vers le foie^4,5. Des modèles animaux suggèrent que les bactéries ingérées se répliquent dans les villosités intestinales et transitent vers le foie par la veine portique ou se propagent via les ganglions lymphatiques mésentériques dans la circulation sanguine, conduisant à une dissémination hématogène au foie et à la rate^6,7. Dans le foie et la rate, la bactérie est capable de médiatiser l’absorption dans les phagocytes professionnels ainsi que dans les cellules parenchymateuses résidentes, et établit rapidement des infections dans ces organes. À mesure que la charge bactérienne augmente, de nombreuses bactéries sont dispersées dans le sang, où elles sont capables de coloniser davantage les tissus sensibles, y compris le système nerveux central et le placenta (le cas échéant). La colonisation de ces sites exclut les manifestations les plus courantes de listériose chez l’homme, y compris la méningite, l’encéphalite et l’avortement fœtal^2.

Il a récemment été démontré que certaines sous-populations de L. monocytogenes ont une capacité accrue d’envahir et de se répliquer dans les tissus cardiaques⁸. Les manifestations de la participation cardiaque sont variées, et vont de l’endocardite et de la péricardite, à la myocardite fulminante complète avec des anomalies de conduction^9-13. Le nombre total de cas cardiaques de L. monocytogenes par an est faible mais peut être sous-estimé car cette facette de l’infection n’est généralement pas bien identifiée. La colonisation du cœur par des agents pathogènes nécessite souvent des prédispositions de l’hôte telles que des dommages valvulaires préexistants ou des valves cardiaques artificielles. Il existe cependant des isolats de L. monocytogenes qui ont été identifiés et qui se distinguent par leur capacité à coloniser le cœur d’animaux infectés en l’absence de dommages cardiaques et/ou d’anomalies⁸.

Ici sont décrites des méthodes in vitro et in vivo pour évaluer la colonisation bactérienne du tissu cardiaque chez les animaux infectés à l’aide d’essais d’invasion dans la culture tissulaire ainsi que des infections animales vivantes. Ces méthodes se sont avérées utiles non seulement pour identifier les souches ayant le potentiel de coloniser le tissu cardiaque chez les animaux infectés, mais devraient également être utiles pour l’identification des produits génétiques bactériens qui servent à améliorer l’invasion cellulaire cardiaque et /ou entraînent des changements dans la pathologie cardiaque. Ces méthodes facilitent la comparaison du cardiotropisme entre plusieurs souches. Pour les méthodes décrites ici, L. monocytogenes 10403S est utilisé comme représentant bien étudié d’une souche non cardiotrope et l’isolat clinique 07PF0776 est utilisé comme exemple représentatif d’une souche cardiotrope. Ces deux souches ont été choisies pour fournir une comparaison pour l’invasion bactérienne des cellules cardiaques in vitro et la colonisation des cœurs de souris infectées in vivo. L’isolat 07PF0776 est un isolat clinique récupéré d’un abcès interventriculaire qui a causé une arythmie mortelle chez un patient ATTEINT DU VIH+^8. Les isolats de L. monocytogenes peuvent varier dans leur potentiel de virulence, et étant donné la propension de Listeria à infecter les personnes immunodéprimées et les femmes enceintes, les personnes de ces populations doivent faire preuve de prudence lorsqu’elles évaluent différents isolats cliniques.

Protocol

1. Conditions d’entreposage et de culture des souches de L. monocytogenes Préparez des milieux solides en autoclavant la gélose à perfusion cerveau-cœur (BHI) et en versant le milieu fondu dans des plaques de Pétri. Laisser sécher les plaques pendant la nuit à température ambiante, puis pendant une nouvelle nuit à 37 °C. À l’aide d’une boucle stérile, obtenir un petit échantillon de L. monocytogenes à partir de stocks congélateurs fabriqués précédemment (bact…

Representative Results

Les isolats choisis de monocytogenes de L. montrent l’invasion augmentée des cellules cardiaques dans la culture cellulaire et dans les modèles murins d’infection. La figure 1 montre un exemple de la façon dont les colonies bactériennes peuvent apparaître après le placage ponctuel des suspensions sur un support de gélose. Cette méthode permet une évaluation précise des UFC dans un échantillon sans utiliser un grand nombre de plaques de gélose. La figure 2 montre …

Discussion

L. monocytogenes est un agent pathogène humain répandu et bien caractérisé, capable de provoquer un certain nombre de manifestations différentes de la maladie¹⁵. La bactérie a été précédemment décrite pour sa capacité à se déplacer à travers des barrières, telles que les barrières hémato-encéphaliques et placentaires-fœtales, afin d’atteindre et de coloniser le système nerveux central et le fœtus en développement, respectivement. La capacité in vivo de l’organisme …

Materials

Difco	BHI Broth Base	237200	2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2KG of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14mL Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75cm^2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum