הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה
Summary
ליסטריה מונוציטוגנים גורמת לזיהומים עובריים אצל נשים בהריון ודלקת קרום המוח באוכלוסיות רגישות. תת-אוכלוסיות של חיידקים יכולות ליישב רקמת לב, ולגרום לדלקת שריר הלב בחולים ובחיות מעבדה. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד להעריך L. monocytogenes פלישה לתאי לב במבחנה קולוניזציה לב בבעלי חיים נגועים.
Abstract
ליסטריה מונוציטוגנים הוא פתוגן תאי פקולטטיבי גראם חיובי המסוגל לגרום לזיהומים פולשניים חמורים בחולים immunocompromised, קשישים, ונשים בהריון. הביטויים הנפוצים ביותר של ליסטריוזיס בבני אדם כוללים דלקת קרום המוח, דלקת המוח, הפלה עוברית. סרט המשך משמעותי אך הרבה פחות מתועד של זיהום פולשני L. monocytogenes כרוך בלב. שיעור התמותה ממחלות לב יכול להיות עד 35% למרות הטיפול, אולם מעט מאוד ידוע לגבי L. monocytogenes קולוניזציה של רקמת לב ופתולוגיות וכתוצאה מכך. בנוסף, לאחרונה התברר כי תת-אוכלוסיות של L. monocytogenes יש יכולת משופרת לפלוש ולגדול בתוך רקמת הלב. פרוטוקול זה מתאר בפירוט במבחנה ובשיטות vivo שניתן להשתמש בהם להערכת קרדיוטרופיזם של L. מונוציטוגנים מבודד. שיטות מוצגות לזיהום של myoblasts לב עכברוש H9c2 בתרבית הרקמות, כמו גם לקביעת קולוניזציה חיידקית של לבבות של עכברים נגועים. שיטות אלה שימושיות לא רק לזיהוי זנים בעלי פוטנציאל ליישב רקמת לב בבעלי חיים נגועים, אלא גם להקל על זיהוי של מוצרי גנים חיידקיים המשמשים לשיפור פלישת תאי הלב ו/או לקדם שינויים בפתולוגיה של הלב. שיטות אלה מספקות גם השוואה ישירה של קרדיוטרופיזם בין זנים מרובים L. monocytogenes.
Introduction
ליסטריה מונוציטוגנים הוא פתוגן תאיים גראם חיובי מסוגל לגרום למחלות קשות באוכלוסיות רגישות, כולל קשישים, נשים בהריון, אנשים עם HIV / איידס, ואנשים המקבליםכימותרפיה 1. זיהום באוכלוסיות אלה הוא לעתים קרובות תוצאה של בליעת מוצרי מזון מזוהמים, ורוב הזיהומים קשורים להתפרצויות מזון בקנה מידה גדול2,3. אצל בני אדם ויונקים אחרים, L. monocytogenes הוא מסוגל translocating מעבר לגבול האפיתל של המעי הדק, לאחר מכן מועבר לכבד4,5. מודלים של בעלי חיים מראים כי חיידקים שנבלעו לשכפל בתוך villi מעיים ולעבור לכבד דרך וריד הפורטל או להתפשט דרך בלוטות הלימפה mesenteric לתוך זרם הדם, המוביל הפצה המטוגנית לכבד טחול6,7. בכבד ובטחול, החיידק מסוגל לתווך ספיגה לתוך שני phagocytes מקצועי, כמו גם תאים parenchymal תושב, במהירות קובע זיהומים בתוך איברים אלה. ככל שעומס החיידקים עולה, חיידקים רבים מפוזרים בחזרה לדם, שם הם מסוגלים ליישב עוד יותר רקמות רגישות כולל מערכת העצבים המרכזית ושליה (שם קיים). קולוניזציה של אתרים אלה מונעת את הביטויים הנפוצים ביותר של ליסטריוזיס בבני אדם, כולל דלקת קרום המוח, דלקת המוח, הפלה עוברית2.
אוכלוסיות נבחרות של L. monocytogenes הוכחו לאחרונה יש יכולת משופרת לפלוש ולשכפל בתוך רקמת הלב8. ביטויים של מעורבות בלב הם מגוונים, והם נעים בין אנדוקרדיטיס ודלקת קרום הלב, כדי דלקת שריר הלב fulminant להשלים עם הפרעות הולכה9-13. המספר הכולל של מקרי לב L. monocytogenes בשנה הוא נמוך אבל עשוי להיות תחת הערכה כמו היבט זה של זיהום אינו מוכר בדרך כלל היטב. קולוניזציה של הלב על ידי פתוגנים לעתים קרובות דורש נטייה מארח כגון נזק valvular קיים מראש או שסתומי לב מלאכותיים. ישנם, עם זאת, מבודדים של L. monocytogenes כי זוהו כי הם בולטים ביכולתם ליישב את ליבם של בעלי חיים נגועים בהעדר כל נזק לב ו / או חריגות8.
להלן מתוארים במבחנה ושיטות vivo להערכת קולוניזציה חיידקית של רקמת לב בתוך בעלי חיים נגועים באמצעות מבחני פלישה בתרבית הרקמות, כמו גם זיהומים חיים בבעלי חיים. שיטות אלה הוכיחו שימושי לא רק לזיהוי זנים עם פוטנציאל ליישב רקמת לב בבעלי חיים נגועים, אבל צריך גם להיות שימושי לזיהוי של מוצרי גנים חיידקיים המשמשים כדי לשפר את הפלישה לתאי לב ו / או לגרום לשינויים בפתולוגיה של הלב. שיטות אלה מקלות על השוואת קרדיוטרופיה בין זנים מרובים. עבור השיטות המתוארות כאן, L. monocytogenes 10403S משמש כנציג נחקר היטב של זן שאינו קרדיוטרופי ואת המבודד הקליני 07PF0776 משמש כדוגמה מייצגת של זן קרדיוטרופי. שני זנים אלה נבחרו כדי לספק השוואה לפלישה חיידקית של תאי לב במבחנה ו קולוניזציה של לבבות של עכברים נגועים vivo. הבידוד 07PF0776 הוא מבודד קליני התאושש מורסה בין חדרית שגרמה להפרעות קצב קטלניות בחולה HIV +8. L. מונוציטוגנים מבודדים עשויים להשתנות בפוטנציאל הארסיות שלהם, ובהתחשב בנטייה ליסטריה להדביק אנשים עם דיכוי חיסוני ונשים בהריון, אנשים בתוך אוכלוסיות אלה צריכים לנקוט זהירות תוך הערכת מבודדים קליניים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. מונוציטוגנים הוא פתוגן אנושי נפוץ ומאופיין היטב, המסוגל לגרום למספר ביטויי מחלה שונים15. החיידק תואר בעבר בשל יכולתו לעבור בין מחסומים, כגון מחסום הדם – מוח ומחסומי שליה-עובר, על מנת להגיע וליישב את מערכת העצבים המרכזית ואת העובר המתפתח, בהתאמה. היכולת in vivo של האורגניזם ליי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור מעניק AI41816 ו AI099339 (N.E.F.) ועל ידי F31AI094886-01 (P.D.M.) מ NIAID. התכנים הם באחריות המחברים בלבד ואינם מייצגים בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של מקורות המימון.
Materials
| Difco | BHI Broth Base | 237200 | 2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar) |
| Difco | Agar | 214510 | 2KG of Granulated Agar |
| Difco | BHI Agar | 241810 | 2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar |
| in vitrogen | LB Broth Base | 12975-084 | 2KG of Luria Broth Base Powder (without agar) |
| Fisher | Glass Coverslips | 12-545-80 | 12mm glass coverslips |
| Falcon | 24-well Tissue Culture Plate | 35-3047 | 24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate |
| Falcon | 14mL Polystyrene tube | 352051 | 14mL Polystyrene tubes |
| Falcon | 96-well U-bottom plate | 35-3077 | Non-tissue culture treated 96-well plate |
| Corning | 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) | 25-052-CI | Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture |
| Corning | DMEM (High glucose, high pyruvate) | 15-013-CU | DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics |
| Corning | Pen/Strep/Glut Solution | 30-009-CI | Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture |
| Corning | Gentamicin | 30-005-CR | 50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture |
| Cellgro (Corning) | L-Glutamine | 25005197 | Stock L-glutamine solution without antibiotics |
| Denville | 75cm^2 Flask | T1225 | 75cm^2 tissue culture treated flask |
| Denville | 1.5mL microcentrifuge tubes | 2013004 | 1.5mL microcentrifuge tubes |
| ATCC | H9c2 Cardiac Myoblasts | CRL-1446 | Rat cardiac myoblasts |
| Hyclone | Fetal Bovine Serum | SH30070.63 | Fetal Bovine Serum |
References
- Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
- Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
- Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
- Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
- Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
- Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).
- Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
- Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
- Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
- Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
- Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
- Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
- McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
- Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
- Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
- Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
- Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).
- Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
- McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552 (2012).
