Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Summary

Listeria monocytogenes causa infecciones fetales en mujeres embarazadas y meningitis en poblaciones susceptibles. Las subpoblaciones de bacterias pueden colonizar el tejido cardíaco, causando miocarditis en pacientes y animales de laboratorio. Aquí presentamos un protocolo que describe cómo evaluar la invasión de células cardíacas de L. monocytogenes in vitro y la colonización cardíaca en animales infectados.

Abstract

Los monocytogenes de la listeriería son un patógeno intracelular facultativo Gram-positivo que es capaz de causar infecciones invasores serias en pacientes immunocompromised, los ancianos, y las mujeres embarazadas. Las manifestaciones mas comunes de la listeriosis en seres humanos incluyen meningitis, encefalitis, y aborto fetal. Una secuela significativa pero mucho menos documentada de la infección invasor de los monocytogenes del L. implica el corazón. La tasa de mortalidad por enfermedad cardíaca puede ser de hasta el 35% a pesar del tratamiento, sin embargo se sabe muy poco sobre la colonización de L. monocytogenes del tejido cardíaco y sus patologías resultantes. Además, recientemente se ha hecho evidente que las subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad para invadir y crecer dentro del tejido cardíaco. Este protocolo describe detalladamente los métodos ines vitro e in vivo que se pueden utilizar para determinar cardiotropism de los aislantes de los monocytogenes del L. Los métodos se presentan para la infección de los mioblastos cardiacos de la rata H9c2 en cultura del tejido así como para la determinación de la colonización bacteriana de los corazones de ratones infectados. Estos métodos son útiles no sólo para identificar tensiones con el potencial de colonizar el tejido cardiaco en animales infectados, pero pueden también facilitar la identificación de los productos bacterianos del gen que sirven para aumentar la invasión de la célula cardiaca y/o para conducir cambios en patología del corazón. Estos métodos también proporcionan la comparación directa del cardiotropismo entre múltiples cepas de L. monocytogenes.

Introduction

Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular Gram-positivo capaz de causar enfermedades graves en poblaciones susceptibles, incluyendo ancianos, mujeres embarazadas, personas con VIH/SIDA y personas que reciben quimioterapia¹. La infección en estas poblaciones es frecuentemente el resultado de la ingestión de productos alimenticios contaminados, y la mayoría de las infecciones están asociadas con brotes alimentarios a gran escala^2,3. En humanos y otros mamíferos, L. monocytogenes es capaz de translocar a través de la frontera epitelial del intestino delgado, siendo posteriormente transportado al hígado^4,5. Los modelos animales sugieren que las bacterias ingeridas se repliquen dentro de las vellosidades intestinales y transiten al hígado a través de la vena porta o se propaguen a través de los ganglios linfáticos mesentéricos hacia el torrente sanguíneo, lo que lleva a la diseminación hematógena al hígado y al bazo^6,7. En el hígado y el bazo, la bacteria es capaz de mediar en fagocitos profesionales, así como en las células parenquimatosas residentes, y establece rápidamente infecciones dentro de estos órganos. A medida que aumenta la carga bacteriana, numerosas bacterias se dispersan de nuevo en la sangre, donde son capaces de colonizar aún más los tejidos susceptibles, incluyendo el sistema nervioso central y la placenta (donde esté presente). La colonización de estos sitios excluye las manifestaciones más comunes de listeriosis en humanos, incluyendo meningitis, encefalitis y aborto fetal².

Recientemente se ha demostrado que determinadas subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad de invadir y replicarse dentro del tejido cardíaco⁸. Las manifestaciones de afectación cardíaca son variadas, y van desde la endocarditis y la pericarditis, hasta la miocarditis fulminante completa con anomalías de conducción^9-13. El número total de casos cardiacos de los monocytogenes del L. por año es bajo pero puede debajo estimado pues esta faceta de la infección no se reconoce generalmente bien. La colonización del corazón por patógenos a menudo requiere predisposiciones del huésped, como daño valvular preexistente o válvulas cardíacas artificiales. Existen, sin embargo, aislados de L. monocytogenes que han sido identificados que son notables por su capacidad de colonizar los corazones de animales infectados en ausencia de cualquier daño cardíaco y/o anormalidades⁸.

Adjunto se describen in vitro e in vivo los métodos para evaluar la colonización bacteriana del tejido cardiaco dentro de animales infectados usando análisis de la invasión en cultura del tejido así como infecciones animales vivas. Estos métodos han demostrado ser útiles no sólo para identificar cepas con el potencial de colonizar el tejido cardíaco en animales infectados, sino que también deben ser útiles para la identificación de productos de genes bacterianos que sirven para mejorar la invasión de células cardíacas y / o dar lugar a cambios en la patología del corazón. Estos métodos facilitan la comparación del cardiotropismo entre múltiples cepas. Para los métodos descritos aquí, L. monocytogenes 10403S se utiliza como un representante bien estudiado de una cepa no cardiotrópica y el aislado clínico 07PF0776 se utiliza como un ejemplo representativo de una cepa cardiotrópica. Estas dos cepas se eligieron para proporcionar una comparación para la invasión bacteriana de células cardíacas in vitro y la colonización de corazones de ratones infectados in vivo. El aislado 07PF0776 es un aislado clínico recuperado de un absceso interventricular que causó una arritmia fatal en un paciente VIH+^8. Los aislados de L. monocytogenes pueden variar en su potencial de virulencia, y dada la propensión de Listeria a infectar a personas con inmunosupresión y mujeres embarazadas, las personas dentro de estas poblaciones deben tener cuidado al evaluar diferentes aislados clínicos.

Protocol

1. Condiciones de almacenamiento y cultivo para cepas de L. monocytogenes Prepare medios sólidos autoclavando agar de infusión cerebro-corazón (BHI) y vertiendo los medios fundidos en placas de Petri. Deje que las placas se sequen durante la noche a temperatura ambiente, luego vuelva a pasar la noche a 37 °C. Usando un lazo estéril, obtenga una pequeña muestra de L. monocytogenes de cualquiera de las existencias previamente hechas del congelador (bacterias suspendidas en glice…

Representative Results

Los aislantes seleccionados de los monocytogenes del L. exhiben la invasión aumentada de células cardiacas en cultivo celular y en modelos del ratón de la infección. La Figura 1 muestra un ejemplo de cómo pueden aparecer colonias bacterianas después del revestimiento puntual de suspensiones en medios de agar. Este método permite una evaluación precisa de las UFC dentro de una muestra sin utilizar un gran número de placas de medios de agar. La Figura 2 muestra un ejemplo…

Discussion

L. monocytogenes es un patógeno humano extendido y bien caracterizado, capaz de causar una serie de manifestaciones diferentes de la enfermedad¹⁵. La bacteria se ha descrito previamente por su capacidad de translocar a través de barreras, como la barrera hematoencefálica y las barreras placentario-fetales, con el fin de alcanzar y colonizar el sistema nervioso central y el feto en desarrollo, respectivamente. La capacidad in vivo del organismo para colonizar estos tejidos a menudo se compl…

Materials

Difco	BHI Broth Base	237200	2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2KG of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14mL Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75cm^2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum