Bedömning av bakteriell invasion av hjärtceller i kultur och hjärtkolonisering hos infekterade möss med hjälp av Listeria monocytogenes

Summary

Listeria monocytogenes orsakar fetala infektioner hos gravida kvinnor och hjärnhinneinflammation i mottagliga populationer. Subpopulationer av bakterier kan kolonisera hjärtvävnad, vilket orsakar hjärtmuskelinflammation hos patienter och försöksdjur. Här presenterar vi ett protokoll som beskriver hur man bedömer L. monocytogenes hjärtcellsinvasion in vitro och hjärtkolonisering hos infekterade djur.

Abstract

Listeria monocytogenes är en Gram-positiv fakultets intracellulär patogen som kan orsaka allvarliga invasiva infektioner hos immunkomprometterade patienter, äldre och gravida kvinnor. De vanligaste manifestationerna av listerios hos människor inkluderar hjärnhinneinflammation, encefalit och fetala abort. En betydande men mycket mindre dokumenterade och sviter av invasiva L. monocytogenes infektion innebär hjärtat. Dödstalet från hjärtsjukdomar kan vara upp till 35% trots behandling, men mycket lite är känt när det gäller L. monocytogenes kolonisering av hjärtvävnad och dess resulterande patologier. Dessutom har det nyligen blivit uppenbart att subpopulationer av L. monocytogenes har en förbättrad kapacitet att invadera och växa inom hjärtvävnad. Detta protokoll beskriver i detalj in vitro och in vivo metoder som kan användas för att bedöma kardiotropism av L. monocytogenes isolat. Metoder presenteras för infektion av H9c2 råtta hjärt myoblaster i vävnad kultur samt för bestämning av bakteriell kolonisering av hjärtan hos infekterade möss. Dessa metoder är användbara inte bara för att identifiera stammar med potential att kolonisera hjärtvävnad hos infekterade djur, men kan också underlätta identifiering av bakteriella genprodukter som tjänar till att förbättra hjärtcellsinvasion och / eller driva förändringar i hjärtpatologi. Dessa metoder ger också den direkta jämförelsen av kardiotropism mellan flera L. monocytogenes stammar.

Introduction

Listeria monocytogenes är en Gram-positiv intracellulär patogen som kan orsaka allvarlig sjukdom hos mottagliga populationer, inklusive äldre, gravida kvinnor, personer med HIV/ AIDS och personer som får kemoterapi¹. Infektion i dessa populationer är ofta resultatet av intag av förorenade livsmedelsprodukter, och de flesta infektioner är förknippade med storskaliga livsmedelsburna^{utbrott 2,3}. Hos människor och andra däggdjur kan L. monocytogenes förflytta sig över tunntarmens epitelgräns och därefter transporteras till^{levern 4,5}. Djurmodeller tyder på att intagna bakterier replikerar i tarm villi och transitering till levern genom portal venen eller sprids via de mesenteriiska lymfkörtlarna i blodet, vilket leder till hematogen spridning till levern och mjälte^6,7. I levern och mjälten kan bakterien förmedla upptag i både professionella fagocyter samt bosatta parenkymala celler och etablerar snabbt infektioner i dessa organ. När bakteriebelastningen ökar sprids många bakterier tillbaka i blodet, där de kan ytterligare kolonisera mottagliga vävnader inklusive centrala nervsystemet och placentan (där den finns). Kolonisering av dessa platser utesluter de vanligaste manifestationerna av listerios hos människor, inklusive hjärnhinneinflammation, encefalit och fetala abort².

Utvalda subpopulationer av L. monocytogenes har nyligen visat sig ha en förbättrad kapacitet att invadera och replikera inom hjärtvävnad⁸. Manifestationer av hjärtat engagemang är varierade, och sträcker sig från endokardit och hjärtsäcksinflammation, till fulminant hjärtmuskelinflammation komplett med resistiv avvikelser^9-13. Det totala antalet L. monocytogenes hjärtfall per år är lågt men kan vara under uppskattat eftersom denna aspekt av infektion inte är allmänt väl erkända. Kolonisering av hjärtat av patogener kräver ofta värd predispositioner som befintliga valvulära skador eller konstgjorda hjärtklaffar. Det finns dock isolat av L. monocytogenes som har identifierats som är anmärkningsvärda för deras förmåga att kolonisera hjärtan hos infekterade djur i avsaknad av hjärtskador och / eller avvikelser⁸.

Häri beskrivs in vitro- och in vivo-metoder för att bedöma bakteriell kolonisering av hjärtvävnad hos infekterade djur med hjälp av invasionsanalyser i vävnadskultur samt levande djurinfektioner. Dessa metoder har visat sig vara användbara inte bara för att identifiera stammar med potential att kolonisera hjärtvävnad hos infekterade djur, men bör också vara användbara för identifiering av bakteriella genprodukter som tjänar till att förbättra hjärtcellsinvasion och/ eller resultera i förändringar i hjärtpatologi. Dessa metoder underlättar jämförelsen av kardiotropism mellan flera stammar. För de metoder som beskrivs här används L. monocytogenes 10403S som en välstuderad representant för en icke-kardiotropisk stam och det kliniska isolatet 07PF0776 används som ett representativt exempel på en kardiotropisk stam. Dessa två stammar valdes för att ge en jämförelse för bakteriell invasion av hjärtceller in vitro och kolonisering av hjärtan hos infekterade möss in vivo. Isolatet 07PF0776 är ett kliniskt isolat som återfunnits från en interventricular böld som orsakade en dödlig arytmi hos en HIV + patient⁸. L. monocytogenes isolat kan variera i deras virulens potential, och med tanke på benägenheten för Listeria att infektera personer med immunsuppression och gravida kvinnor, personer inom dessa populationer bör iaktta försiktighet vid bedömning av olika kliniska isolat.

Protocol

1. Lagrings- och kulturförhållanden för L. monocytogenes-stammar Förbered fasta medier genom att autoklavera hjärn-hjärta infusion agar (BHI) och hälla smälta medier i petriplattor. Låt plattorna torka över natten vid rumstemperatur och övernatta sedan igen vid 37 °C. Använd en steril slinga, få ett litet prov av L. monocytogenes från antingen tidigare tillverkade fryslager (bakterier upphängda i 20% glycerol i BHI flytande medier, lagrade vid -80 °C) eller från en…

Representative Results

Utvalda isolat av L. monocytogenes uppvisar förbättrad invasion av hjärtceller i cellkulturen och i musmodeller av infektion. Figur 1 visar ett exempel på hur bakteriekolonier kan förekomma efter spotplätering av suspensioner på agarmedier. Denna metod möjliggör korrekt bedömning av CFUs i ett prov utan att använda ett stort antal agar mediaplattor. Figur 2 visar ett exempel på en vävnadskulturbaserad analys som jämför stammens förmåga 10403S att invadera hjärt…

Discussion

L. monocytogenes är en utbredd och väl karakteriserad mänsklig patogen, som kan orsaka ett antal olika sjukdom manifestationer¹⁵. Bakterien har tidigare beskrivits för sin förmåga att flytta över barriärer, såsom blod-hjärnbarriären och placenta-fetala barriärer, för att nå och kolonisera centrala nervsystemet respektive utveckla fostret. Organismens in vivo-förmåga att kolonisera dessa vävnader kompletteras ofta av en in vitro-förmåga att invadera de representativ…

Materials

Difco	BHI Broth Base	237200	2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco	Agar	214510	2KG of Granulated Agar
Difco	BHI Agar	241810	2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen	LB Broth Base	12975-084	2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher	Glass Coverslips	12-545-80	12mm glass coverslips
Falcon	24-well Tissue Culture Plate	35-3047	24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon	14mL Polystyrene tube	352051	14mL Polystyrene tubes
Falcon	96-well U-bottom plate	35-3077	Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning	0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning	DMEM (High glucose, high pyruvate)	15-013-CU	DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning	Pen/Strep/Glut Solution	30-009-CI	Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning	Gentamicin	30-005-CR	50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning)	L-Glutamine	25005197	Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville	75cm^2 Flask	T1225	75cm^2 tissue culture treated flask
Denville	1.5mL microcentrifuge tubes	2013004	1.5mL microcentrifuge tubes
ATCC	H9c2 Cardiac Myoblasts	CRL-1446	Rat cardiac myoblasts
Hyclone	Fetal Bovine Serum	SH30070.63	Fetal Bovine Serum