שימוש בתאים סרטניים עכבר החלב ללמד מושגי ביולוגיה Core: מודול מעבדה פשוט
Summary
A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.
Abstract
Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.
Introduction
לעתים קרובות בקורסי ביולוגיה כללית לתואר ראשון, בנושאים של רגולציה מחזור התא וסרטן נגעו אך לא נחקרו בפירוט כי רוחבו של תוכן בקורסים אלה משאיר מעט מאוד זמן לעומק. בנוסף, סטודנטים לתואר ראשון בביולוגיה אינם חשופים בדרך כלל לטכניקות המתקדמות הקשורות לתרבות תא של בעלי החיים. כדי לסייע לתלמידים לפתח הבנה עמוקה יותר של מושגים אלה, תוך יישום והניתוח מה שהם למדו, פעילות מעבדה פותחה כשינוי של וולטר ריד צבא מכון המחקר (WRAIR) הרחיב את פעילות המעבדה 1. מודול המעבדה משתמש ב, אסטרטגיה ניסיונית צעד חכם שכוללת גידול ואפיון מודל של תאי סרטן, בפיתוח ובביצוע שיטות ספירת תאים, ההקמה כמובן זמן אופטימלי ומינונים לטיפול בתאים עם סוכנים אנטי-שגשוג, וזיהוי מסלולי איתות תאים חריגים . הניסוי גם מאפשר פתוחהודעה -ended.
רוב הטכניקות הנדרשות לפעילות זו יכולה להתבצע במעבדה הוראת ביולוגיה-טיפוסית. הפעילות מתחילה עם תלמידים המאפיינים את שיעור המורפולוגיה וצמיחה של קו התאים סרטני החלב עכבר (MMT), מודל לסרטן השד אנושי 2. סרטן השד נבחר כמודל הסרטן בגלל שכיחותה באוכלוסייה, היכרותה לתלמידים בגילי קולג ', ונתונים נרחבים הזמינים. שורת תאי MMT נבחרה במיוחד משום שהוא בר השגה בקלות, מאופיין היטב, יש זמן הכפלה קצר וקל לגדול. בנוסף, תאי MMT הם תלויים באסטרוגן אשר עולה בקנה אחד עם רוב מקרי סרטן השד נשיים. תלמידים לאחר מכן לזהות מסלולי איתות תאים חריגים בתאי MMT על ידי טיפול בתאים עם תרופות כימותרפיות מנגנון פעולה שלו הוא גם established.The ריכוז של התרופות והאורך של הטיפולים מגוונים המאפשרים לתלמידיםכדי להעריך את ההשפעה של המשתנים הללו על קצב חלוקת תאים. Assay מפתח לפעילות זו הוא קביעת כדאיות תא, שפשוט דורשת ספירת תאים, באמצעות אחת משתי שיטות. כל שיטה תלויה בכישורי מיקרוסקופ חזקים. תלמידים לקבוע כדאיות תא על ידי שימוש סטנדרטי, שיטת hemocytometer ושיטת photomicroscopy רומן ולהציע. בהתבסס על הממצאים שלהם, הם יכולים להציע ולבחון שינויים בפעילות. תלמידים אז לייצג את הנתונים שלהם ולפרש את התוצאות כדי לחדד את השערתם ולתכנן אסטרטגיות ניסיוניות חדשות.
פעילות מעבדה זה מתאים לתלמידי כיתה ט 'או בכיתה י' ברמת התמחות במדעים הביולוגיים. הוא מרוכז במודול מעבדה של שבוע שניתן להשלים בשנה ראשונה, ביולוגיה כללית או שנה שנייה, כמובן ביולוגיה תאית / מולקולריים. כישורים דרושים להשלמה נכונה של הפעילות כוללים חשבון בסיסי ואלגברה, היכרות עם מערך של גמיומנויות מעבדה עפרות (למשל, pipetting, פתרון קבלת, טכניקה סטרילית), ניתוח נתונים, ניהול מיקרוסקופ האור והזמן בסיסי, יחד עם ידע מורה של תרבית תאים ותוכנת גיליון אלקטרוני. ריאגנטים הנדרשים כוללים מודל שורת התאים של בעלי חיים לסרטן (לדוגמא, תאי החלב עכבר גידול, MMT 2), סוכני כימותרפיה (למשל, טמוקסיפן, כורכום, מטפורמין, ואספירין), תקשורת והתרבות כחולה ותא trypan (למשל, בינוני חיונית המינימלית של הנשר ; EMEM) עם תוספי מזון מתאימים (למשל, סוס תורם וסרום שור עוברי). מכשירים הדרושים כוללים מיקרוסקופ הפוך אור עם קובץ מצורף מצלמה דיגיטלית, מחשב, 100 מ"מ ו -24 צלחות תרבית רקמה היטב, CO 2 באינקובטור (או שווה ערך), ארון בטיחות ביולוגית (BSC; Class II), hemocytometer, ותוכנת מיקרוסקופיה דיגיטלית.
ישנן דוגמאות טובות של פעילויות מעבדה ספציפיות המסתמכות על תרבות תאים של בעלי החיים לTEACסטודנטים לתואר ראשון h על מושגים בביולוגיה של תא 3. עם זאת רבים דורשים אספקה או טכניקות שאינן נגישים בקלות (למשל, איזוטופים רדיואקטיביים, רקמת חיה של בעלי חיים, ציוד הדמיה מתקדם 1,4,5), מתארים פרוטוקולים שהם די מתקדמים (למשל, מתאימים לקורס 400 רמה 6), או דורשים פרויקטים ארוכים רב-שבוע סמסטר או 6,7. פעילות המעבדה המתוארת כאן היא פשוטה ויכולה להיות שנערכה בשבוע עם ציוד מעבדה משותף אחת.
לסיכום, מעבדה מודול זה ביעילות מציג או מחזק את המושגים של מחזור תא, מסלולי איתות תאיים וסרטן תוך הקניית מיומנויות בסיסיות ומתקדמות במעבדה, ניתוח נתוני ניסוי, השיטה של תרבית תאים של בעלי חיים ואת התהליך המדעי. מודול המעבדה הוא פשוט ונגיש מבחינה כלכלית והן מספק גמישות והזדמנות לחקירה פתוחה. הפעילות מעודדת את יצירתיות תלמידעל ידי מתן אסטרטגיה ניסיונית תבנית שפועלת כמדריך, אבל לא מתכון. והכי חשוב, מספק פעילות בכל תחומי הלימוד של טקסונומיה פורח 8 כפי שהוא דורש לזכור, הבנה, יישום, ניתוח, הערכה ויצירה על ידי העוסק תלמידים בתהליך שמושך אותם אל מחוץ לספר הלימוד ולתוך העולם של מחקר מדעי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודול מעבדה מוצג שמטרתו ללמד מגוון של נושאים בביולוגיה של תא בטכניקות המתקדמות של תרבית תאים של בעלי החיים. מודול משיג זאת על ידי ניתוח ההשפעות של מספר הכימיקלים אנטי-שגשוג על השכפול של תאים שמודל סרטן השד אנושי. Assay העיקרי מסתמך על הטכניקה הבסיסית של ספירת תאים ומציג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.
Materials
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 uL Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1000 uL Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 mL Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24-well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 mL, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 mL |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 mL |
| Meformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. u. s. a. n. D. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. . A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom’s Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. . Appendix A – Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. . Basic Cell Culture: A Practical Approach. , (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an ‘old-age’ disease with an ‘age-old’ solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician–the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
