Utilizzando il mouse cellule tumorali mammarie per insegnare concetti di biologia di base: un modulo di laboratorio semplice
Summary
A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.
Abstract
Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.
Introduction
Spesso in corsi di biologia generale, di laurea, i temi della regolazione del ciclo cellulare e cancro sono toccati, ma non approfondite in particolare perché l'ampiezza del contenuto di questi corsi lascia poco tempo per la profondità. Inoltre, gli studenti di biologia universitari in genere non sono esposti alle tecniche avanzate associate a colture cellulari animali. Per aiutare gli studenti a sviluppare una più profonda comprensione di questi concetti, durante l'applicazione e l'analisi di ciò che hanno imparato, una attività di laboratorio è stato sviluppato come una modifica del Walter Reed Army Institute di Ricerca (WRAIR) ha esteso l'attività di laboratorio 1. Il modulo laboratorio utilizza una strategia di sperimentazione graduale che include crescere e caratterizzare un modello di cellula tumorale, lo sviluppo e l'esecuzione di metodi di conteggio delle cellule, che stabilisce decorso ottimale e dosaggi per il trattamento di cellule con agenti anti-proliferativi, e individuando percorsi di segnalazione cellulare aberranti . L'esperimento consente inoltre apertoRichiesta -ended.
La maggior parte delle tecniche necessarie per questa attività può essere realizzato in un tipico laboratorio di biologia insegnamento. L'attività inizia con gli studenti che caratterizzano il tasso di morfologia e di crescita della linea di cellule tumorali del mouse mammaria (MMT), un modello per il cancro al seno umano 2. Il cancro al seno è stato scelto come modello di cancro a causa della sua prevalenza nella popolazione, la conoscenza di studenti universitari età, ed i dati diffusi disponibili. La linea cellulare MMT è stato appositamente selezionato perché è facilmente ottenibile, ben caratterizzato, ha un tempo di raddoppio breve ed è facile da coltivare. Inoltre, le cellule MMT sono estrogeno-dipendente, che è in linea con la maggior parte dei tumori al seno femminile. Gli studenti poi identificare i percorsi di segnalazione cellulare aberrante nelle cellule MMT trattando le cellule con farmaci chemioterapici cui meccanismo d'azione è ben established.The concentrazione dei farmaci e la lunghezza dei trattamenti sono variati consentendo agli studentiper valutare l'effetto di queste variabili sul tasso di divisione cellulare. Il test chiave per questa attività è la determinazione della vitalità cellulare, che richiede semplicemente il conteggio delle cellule, utilizzando uno dei due metodi. Ogni metodo dipende forti competenze microscopia. Gli studenti di determinare la vitalità cellulare, utilizzando un normale metodo emocitometro e un metodo photomicroscopy romanzo e propongono. Sulla base dei loro risultati, che possono proporre e testare le modifiche all'attività. Gli studenti poi rappresentano i loro dati e interpretare i risultati per perfezionare la loro ipotesi e mettere a punto nuove strategie sperimentali.
Questa attività di laboratorio è adatto per matricole o livello sophomore studenti, la specializzazione in scienze biologiche. Si è condensato in un modulo di laboratorio di una settimana che può essere completato in un primo anno, biologia generale e secondo anno, cellulare / molecolare corso di biologia. Competenze necessarie per il corretto completamento dell'attività includono aritmetica di base e algebra, la familiarità con una serie di ccompetenze di laboratorio minerale (per esempio, pipettaggio, fabbricazione soluzione tecnica sterile), l'analisi dei dati, la microscopia ottica e la gestione del tempo di base, insieme con la conoscenza istruttore di coltura cellulare e software del foglio elettronico. Reagenti richiesti comprendono un modello linea di cellule animali per il cancro (ad esempio, il mouse mammari cellule tumorali, MMT 2), agenti chemioterapici (ad esempio, il tamoxifene, la curcumina, la metformina, e aspirina), trypan blu cultura e di cellule di supporto (ad esempio, Minimum Essential Medium dell'Aquila ; EMEM) con i supplementi adeguati (per esempio, a cavallo dei donatori e siero fetale bovino). Gli strumenti necessari sono un microscopio invertito luce con attacco fotocamera digitale, computer, 100 mm e 24 piastre di coltura dei tessuti e, di CO 2 incubatore (o equivalente), armadio biosicurezza (BSC; classe II), emocitometro, e il software di microscopia digitale.
Ci sono buoni esempi di specifiche attività di laboratorio che si basano su colture cellulari animali a Teacstudenti universitari h sui concetti di biologia cellulare 3. Tuttavia molti richiedono forniture o tecniche che non sono facilmente accessibili (ad esempio, gli isotopi radioattivi, tessuti di animali vivi, attrezzature avanzate di imaging 1,4,5), descrivono i protocolli che sono abbastanza avanzati (ad esempio, adatto per un corso di 400 livello 6), o richiedere più settimane o semestre progetti lunghi 6,7. L'attività di laboratorio qui descritto è semplice e può essere effettuata in una sola settimana, con apparecchiature di laboratorio comune.
In sintesi, questo modulo laboratorio introduce efficacemente o rafforza i concetti di ciclo cellulare, vie di segnalazione cellulare e cancro, mentre l'insegnamento delle competenze di laboratorio di base e avanzate, analisi dei dati sperimentali, il metodo di coltura delle cellule animali e il processo scientifico. Il modulo di laboratorio è semplice ed economicamente accessibile e offre sia la flessibilità e opportunità per l'inchiesta a tempo indeterminato. L'attività incoraggia la creatività degli studentifornendo una strategia sperimentale modello che funge da guida, ma non una ricetta. Ancora più importante, l'attività soddisfa tutti i domini di apprendimento di Blooms Tassonomia 8 come si richiede a ricordare, la comprensione, l'applicazione, l'analisi, la valutazione e la creazione coinvolgendo gli studenti in un processo che li tira fuori del libro di testo e nel mondo della ricerca scientifica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un modulo laboratorio è presentato che si propone di insegnare una varietà di argomenti in biologia cellulare attraverso le tecniche avanzate di coltura delle cellule animali. Il modulo realizza questo analizzando gli effetti di una serie di sostanze chimiche antiproliferativi sulla replicazione di cellule che modello di cancro al seno umano. Il saggio primario si basa sulla tecnica fondamentale del conteggio delle cellule e introduce un nuovo modo per contare le cellule usando il software microscopia. Le attività ch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.
Materials
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 uL Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1000 uL Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 mL Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24-well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 mL, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 mL |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 mL |
| Meformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. u. s. a. n. D. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. . A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom’s Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. . Appendix A – Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. . Basic Cell Culture: A Practical Approach. , (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an ‘old-age’ disease with an ‘age-old’ solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician–the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
