Met behulp van de muis Mammary tumorcellen Core Biology Begrippen les te geven: A Simple Lab Module
Summary
A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.
Abstract
Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.
Introduction
Vaak in undergraduate algemene biologie cursussen, de onderwerpen van de regulatie van de celcyclus en kanker worden aangestipt, maar niet in detail onderzocht, omdat de breedte van de inhoud van deze cursussen laat weinig tijd voor diepte. Daarnaast worden gegradueerde biologiestudenten niet typisch blootgesteld aan geavanceerde technieken in verband met dierlijke celkweek. Om studenten te helpen ontwikkelen van een dieper begrip van deze concepten, terwijl de toepassing en het analyseren van wat ze geleerd hebben, werd een laboratorium activiteit ontwikkeld als een wijziging van het Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) uitgebreid laboratorium activiteit 1. Het laboratorium module gebruikt een stapsgewijze experimentele strategie die ook groeien en karakteriseren van een kankercel model, het ontwikkelen en uitvoeren celtelling werkwijzen vaststelling optimale tijdsverloop en doseringen voor behandeling van cellen met anti-proliferatieve middelen, en het identificeren van afwijkende cel-signalerende routes . Het experiment laat ook openen-ended onderzoek.
De meeste technieken vereist voor deze activiteit kan worden bereikt in een typisch biologisch onderwijs laboratorium. De activiteit begint met de leerlingen het karakteriseren van de morfologie en groei van de muis borsttumor (MMT) cellijn, een model voor menselijke borstkanker 2. Borstkanker werd gekozen als het model van kanker als gevolg van de prevalentie in de bevolking, de bekendheid van de college-leeftijd studenten, en de wijdverbreide beschikbare gegevens. De MMT cellijn werd speciaal gekozen omdat het gemakkelijk verkrijgbaar, goed gekarakteriseerde, een korte verdubbelingstijd en gemakkelijk te kweken. Daarnaast MMT cellen hormoongevoelige die overeenkomt met meeste vrouwelijke borstkanker. Studenten identificeerden afwijkende cel-signaalroutes in de MMT cellen door de cellen te behandelen met chemotherapie geneesmiddelen waarvan het werkingsmechanisme staat established.The concentratie van de geneesmiddelen en de lengte van de behandeling worden gevarieerd zodat leerlingenhet effect van deze variabelen op de snelheid van celdeling evalueren. De sleutel voor deze activiteit assay is de bepaling van cellevensvatbaarheid, slechts sprake celtelling, via een van twee methoden. Elke methode is afhankelijk van sterke microscopie vaardigheden. Leerlingen bepalen cellevensvatbaarheid met behulp van een standaard, hemocytometer werkwijze en een nieuwe photomicroscopy werkwijze en stelt. Op basis van hun bevindingen kunnen zij voorstellen en test modificaties de activiteit. Studenten vervolgens vertegenwoordigen hun gegevens en interpreteren van de resultaten om hun hypothese te verfijnen en ontwikkelen van nieuwe experimentele strategieën.
Dit laboratorium activiteit is geschikt voor eerstejaars of tweedejaars niveau studenten hoofdvak in de biologische wetenschappen. Het is gecondenseerd in een week lab module die in een eerste jaar kan worden afgerond, algemene biologie of tweede jaar, cellulaire / moleculaire biologie natuurlijk. Vaardigheden die nodig zijn voor een goede uitvoering van de activiteiten omvatten elementaire rekenkunde en algebra, bekendheid met een reeks van core laboratorium vaardigheden (bv, pipetteren, oplossing maken, steriele techniek), data-analyse, basis licht microscopie en time management, samen met een instructeur kennis van celcultuur en spreadsheet-software. Reagentia die nodig zijn een dier cellijn model voor kanker (bijv muizenborsttumorvirus cellen, MMT 2), chemotherapie middelen (bijvoorbeeld tamoxifen, curcumine, metformine en aspirine), trypan blauw en celcultuur media (bijvoorbeeld Eagle's Minimaal Essentieel Medium ; EMEM) met de juiste supplementen (bijv donor paard en foetaal runderserum). Instrumenten die nodig zijn onder meer een omgekeerde lichtmicroscoop met digitale camera gehechtheid, computer, 100 mm en 24 goed weefselkweek platen, CO 2 incubator (of gelijkwaardig), bioveiligheid kast (BSC; Klasse II), hemocytometer en digitale microscopie software.
Er zijn goede voorbeelden van specifieke lab activiteiten die afhankelijk diercelcultuur Teach studenten over concepten in celbiologie 3. Maar veel nodig leveringen of technieken die niet gemakkelijk toegankelijk (bv radioactieve isotopen, levend dierlijk weefsel, geavanceerde imaging apparatuur 1,4,5), beschrijven protocollen die vrij geavanceerde (bijv, geschikt voor een 400-niveau cursus 6) zijn, of vereisen multi-week of semester lang projecten 6,7. De laboactiviteit beschreven is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in een enkele week gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur.
Kortom, dit lab module daadwerkelijk invoert of versterkt de begrippen celcyclus, cellulaire signaalwegen en kanker terwijl onderwijzen basis- en geavanceerde laboratorium vaardigheden experimentele data-analyse, de wijze van diercelcultuur en wetenschappelijke proces. Het laboratorium-module is eenvoudig en economisch toegankelijk en biedt flexibiliteit en mogelijkheid voor open-ended onderzoek. De activiteit stimuleert student creativiteitdoor een template experimentele strategie die fungeert als gids maar geen recept. Belangrijker nog, de activiteit voldoet aan alle domeinen van het leren Blooms taxonomie 8 als het vereist herinneren, begrip, het toepassen, analyseren, evalueren en het creëren door het betrekken van studenten in een proces dat ze uit het handboek en in de wereld van het wetenschappelijk onderzoek trekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een lab module wordt gepresenteerd dat zich richt op een verscheidenheid van onderwerpen in de celbiologie te leren door middel van de geavanceerde technieken van dierlijke celkweek. De module doet dit door het analyseren van de effecten van een aantal anti-proliferatieve stoffen op de vermenigvuldiging van cellen die menselijk borstkankermodel. De primaire test is gebaseerd op de fundamentele techniek celtelling en introduceert een nieuwe manier om cellen microscopische software tellen. De activiteiten die de module ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.
Materials
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 uL Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1000 uL Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 mL Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24-well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 mL, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 mL |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 mL |
| Meformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. u. s. a. n. D. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. . A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom’s Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. . Appendix A – Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. . Basic Cell Culture: A Practical Approach. , (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an ‘old-age’ disease with an ‘age-old’ solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician–the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
