Använda musbrösttumör celler att undervisa Kärn Biologi Concepts: En enkel Lab Modul
Summary
A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.
Abstract
Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.
Introduction
Ofta i grund allmän biologi kurser, är ämnen av cellcykelreglering och cancer berörts men inte utforskat i detalj eftersom bredden av innehållet i dessa kurser lämnar lite tid för djup. Dessutom är grundbiologistudenter normalt inte exponeras för de avancerade tekniker i samband med djurcellodling. För att hjälpa eleverna att utveckla en djupare förståelse av dessa begrepp, samtidigt som och analysera vad de har lärt sig, var en laboratorieverksamhet utvecklats som en modifiering av Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) förlängdes laboratorieverksamhet 1. Labbet modulen använder en stegvis, experimentell strategi som omfattar allt och karakterisera en cancercell modell, utveckla och genomföra cellräkning metoder, inrättande av optimala tidsförloppet och doseringar för behandling av celler med anti-proliferativa medel, och identifiera avvikande cellsignalvägar . Experimentet kan också öppna-ended utredning.
De flesta av de tekniker som krävs för denna aktivitet kan åstadkommas på ett typiskt biologi-undervisande laboratorium. Aktiviteten börjar med studenter som kännetecknar morfologi och tillväxttakten för musbrösttumör (MMT) cellinje, en modell för human bröstcancer 2. Bröstcancer valdes som modell cancer på grund av dess utbredning i befolkningen, dess kännedom till college-äldre studenter och de omfattande uppgifter som finns tillgängliga. MMT-cellinjen var speciellt utvalda eftersom det är lätt att få, väl karakteriserade, har en kort dubbleringstid och är lätt att odla. Dessutom MMT-celler är östrogenberoende, vilket är förenligt med de flesta kvinnliga bröstcancerformer. Eleverna identifierar sedan avvikande cellsignalvägar i MMT-celler genom behandling av cellerna med cytostatika vars verkningsmekanism är väl established.The koncentrationen av läkemedel och längden på behandlingar varierar låta elevernaför att utvärdera effekten av dessa variabler på hastigheten för celldelning. Nyckeln analys för denna verksamhet är att fastställa cellviabilitet, som helt enkelt kräver cellräkning, med hjälp av en av två metoder. Varje metod beror på starka mikroskopi kompetens. Eleverna bestämmer cellviabiliteten med hjälp av en standard, hemocytometer metod och en ny photomicroscopy metod och föreslå. Baserat på deras iakttagelser, kan de föreslå och testa ändringar av verksamheten. Eleverna får sedan företräda sina uppgifter och tolka resultaten för att förfina sin hypotes och utarbeta nya experimentella strategier.
Detta laboratorium verksamhet lämpar sig för nybörjare eller sophomore nivå huvudämnesstuderande i de biologiska vetenskaperna. Det kondenseras i en veckas lab-modul som kan fyllas i på ett första år, allmän biologi eller andra året, cellulär / molekylärbiologi kurs. Färdigheter som behövs för korrekt slutförande av verksamheten omfattar grundläggande aritmetik och algebra, förtrogenhet med en rad cmalm laborativa färdigheter (t.ex. pipettering, lösning gör, sterilteknik), dataanalys, grundläggande ljusmikroskop och tidsplanering, tillsammans med instruktör kunskap om cellkultur och kalkylprogram. Reagens som krävs innefattar en djur cellinje modell för cancer (t.ex. mus brösttumörceller, MMT 2), kemoterapeutiska medel (t.ex. tamoxifen, curcumin, metformin och aspirin), trypanblått och cellodlingsmedia (t.ex., Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) med lämpliga kosttillskott (t.ex. givare häst och fetalt bovint serum). Instrument som behövs bland annat en inverterad ljusmikroskop med digitalkamera kvarstad, dator, 100 mm och 24 vävnadsodlingsplattor, CO 2 inkubator (eller motsvarande), biosäkerhet skåp (BSC, klass II), hemocytometer och digital mikroskope programvara.
Det finns goda exempel på specifika lab verksamheter som är beroende av djurcellkultur till Teach studenter om begrepp i cellbiologi 3. Men många kräver varor eller teknik som inte är lättillgängliga (t.ex. radioaktiva isotoper, levande djurvävnad, avancerad bildutrustning 1,4,5) beskriver protokoll som är ganska avancerade (t.ex. lämpar sig för en 400-nivå kurs 6), eller kräver flera veckor eller termin långa projekt 6,7. Labbet de verksamheter som beskrivs här är enkel och kan utföras i en enda vecka med vanlig laboratorieutrustning.
Sammanfattningsvis denna laboration modul effektivt inför eller förstärker begreppen cellcykeln, cellulära signaleringsvägar och cancer samtidigt undervisa grundläggande och avancerade lab färdigheter, experimentell dataanalys, metoden för djurcellkultur och den vetenskapliga processen. Laboratoriet modulen är enkel och ekonomiskt tillgängliga och ger både flexibilitet och möjlighet till öppen utredning. Aktiviteten uppmuntrar studerande kreativitetgenom att tillhandahålla en mall experimentell strategi som fungerar som en guide men inte ett recept. Viktigast, verksamhets uppfyller alla lärande domäner av Blooms taxonomi 8 eftersom det kräver att minnas, förstå, tillämpa, analysera, utvärdera och skapa genom att engagera eleverna i en process som drar ut dem ur läroboken och i en värld av vetenskaplig forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
En labbmodul presenteras som syftar till att lära en mängd olika ämnen i cellbiologi genom de avancerade tekniker för djur cellodling. Modulen åstadkommer detta genom att analysera effekterna av ett antal anti-proliferativa kemikalier på replikation av celler som modellerar human bröstcancer. Den primära analysen bygger på den grundläggande tekniken för cellräkning och introducerar ett nytt sätt att räkna celler med hjälp av mikroskopi programvara. Verksamheten omfattar modulen kan utföras med instrument…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.
Materials
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 uL Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1000 uL Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 mL Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24-well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 mL, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 mL |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 mL |
| Meformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. u. s. a. n. D. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. . A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom’s Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. . Appendix A – Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. . Basic Cell Culture: A Practical Approach. , (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an ‘old-age’ disease with an ‘age-old’ solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician–the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
