Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l'isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Parce que les variantes de protéines jouent un rôle essentiel dans de nombreuses maladies, y compris TDP-43 dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA), l'alpha-synucléine dans la maladie de et bêta-amyloïde et tau dans la maladie d'Alzheimer, il est extrêmement important de développer des réactifs spécifiques de morphologie qui peuvent cibler sélectivement Parkinson ces protéine spécifique de la maladie variantes d'étudier le rôle de ces variants dans la pathologie de la maladie et pour des applications diagnostiques et thérapeutiques potentielles. Nous avons mis au point de nouveaux microscopie à force atomique (AFM) sur la base des techniques de biopanning qui permettent l'isolement des réactifs qui reconnaissent sélectivement variants protéiques spécifiques à une maladie. Il ya deux phases clés impliqués dans le processus, les phases positives et négatives panoramiques. Pendant la phase de balayage panoramique négatif, les phages qui sont réactifs aux antigènes hors-cible sont éliminés par de multiples cycles de criblage soustractive utilisant une série d'antigènes soigneusement sélectionnés hors-cible. Un élément clé dans la négativephase de panoramique est en utilisant l'imagerie par AFM pour surveiller le processus et de confirmer que toutes les particules de phages indésirables sont enlevés. Pour la phase de balayage panoramique positif, l'antigène cible d'intérêt est fixé sur une surface de mica et les phages liés sont élues et criblée pour identifier les phages qui se lient sélectivement l'antigène cible. La variante de la protéine cible n'a pas besoin d'être purifié fournir les commandes de panoramique négatifs appropriés ont été utilisés. Même cibler des variants de protéines qui sont seulement présentes à de très faibles concentrations en matière biologique complexe peut être utilisé dans l'étape de panning positive. Grâce à l'application de cette technologie, nous avons acquis des anticorps à des variantes de protéines de TDP-43 que l'on retrouve de manière sélective dans le tissu cérébral SLA humaine. Nous nous attendons à ce que ce protocole doit pouvoir se appliquer à des réactifs qui se lient de manière sélective générant variants protéiques présents dans une grande variété de différents procédés biologiques et de maladies.

Introduction

La présence de variants de protéine a été impliqué comme un facteur dans la progression de nombreuses maladies, dont les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la SLA et la démence frontotemporale (DFT) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Formes oligomères de la protéines bêta-amyloïde et l'alpha-synucléine sont pensés pour être les espèces toxiques responsables de la maladie d'Alzheimer et de Parkinson, respectivement ^2,3,4,5. Agrégats de la TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) ont été associés à la SLA et la DFT ^12,13,14. Par conséquent réactifs tels que des anticorps qui peuvent cibler sélectivement les différentes variantes de protéines peuvent être des outils puissants pour servir de marqueurs diagnostiques et thérapeutiques potentiels. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur le développement de réactifs qui se lient sélectivement variants de la protéine TDP-43 impliqué dans la SLA, mais la technique décrite dans ce document devrait être applicable à l'isolement des réactifs contre un large éventail de protVariantes ein.

Agrégation cytoplasmique de TDP-43 a été identifiée comme une caractéristique pathologique de la SLA ^{15,16,17,18,19.} Typiquement TDP-43 se trouve dans le noyau de toutes les cellules d'un individu normal, même si elle a tendance à se déplacer entre le cytosol et le noyau ^15,17. Toutefois les formes, dans la SLA agrégées de TDP-43 sont détectés dans le cytoplasme des neurones et cellules gliales de sélection avec de plus faibles concentrations trouvées dans le noyau suggérant le mouvement de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme au cours de la progression de la maladie ^16,20. Bien que l'agrégation de TDP-43 se trouve dans la majorité des cas de SLA, elle ne tient pas compte de tous les cas étant donné que 1% à 2% des cas de SLA ou total (15% -20% des cas de SLA familiale) sont liées à des mutations dans le superoxyde dismutase 1 (SOD1) ^{de 15,17} génique. En raison de l'importance du rôle du TDP-43 dans la grande majorité des cas de SLA, ici nous nous concentrons sur le développement de réactifs à base d'anticorps qui peuvent se lier sélectivement à TDP-43 variantes qui sontprésent dans le tissu cérébral humain SLA utilisant nos techniques de base biopanning roman AFM.

Au départ, nous devons un répertoire varié de domaines de liaison d'anticorps. Nous avons combiné trois phage display chaîne unique domaine variable fragments d'anticorps différents (scFv), les bibliothèques (Tomlinson I et J et draps bibliothèques ^21). Le processus de panoramique est divisé en phases positives et négatives panoramiques. Les phages provenant des bibliothèques sont d'abord soumis à la procédure de panning négatif au cours de laquelle phages réactif de multiples antigènes hors cibles sont exclus. Après la fin de chaque cycle de lavage négative contre chaque antigène hors cible, le processus est surveillé par imagerie AFM se assurer que tous les antigènes hors cibles contraignantes phage ont été supprimés. Seulement après vérification par l'AFM imagerie que tous les phages réactifs sont retirés ne nous procédons à la prochaine cible. Pour isoler réactifs contre TDP-43 variantes impliqués dans la SLA, nous avons utilisé les antigènes panoramique négatifs suivants: 1) BSA pour éliminer les phages qui se lient faiblement ou de manière non spécifique à des protéines; 2) agrégé alpha-synucléine pour supprimer phage qui se lient à des éléments structurels génériques de protéines agrégées; 3) des homogénats de tissu cérébral humain pour éliminer les phages qui se lient à des protéines ou d'autres composants présents dans les échantillons post-mortem de tissu cérébral humain sain; 4) immunoprécipité TDP-43 à partir de cerveau humain sain pour enlever phage qui se lient à tous TDP-43 formes associées avec le cerveau humain sain; et 5) immunoprécipité TDP-43 isolé de FTD homogénats de cerveau pour enlever phage qui se lient TDP-43 variantes associés à la non-ALS pathologie. Après élimination de tous phage réactif à tous les antigènes hors cible, nous avons ensuite procédé à la phase de balayage panoramique positif au cours de laquelle des fragments d'anticorps qui se lient à l'antigène d'intérêt sont isolés, dans ce cas, TDP-43 immunoprécipitée à partir de tissu cérébral ALS humain. Ces anticorps isolés peuvent être réactif à des formes agrégées ou modifiées de TDP-43.

"> Conventionnelle phage biopanning se concentre principalement sur ​​la phase de balayage panoramique positif ^22,23. Habituellement, la cible d'intérêt est immobilisé, la banque de phages ajoutés et phages liés éluée. Les phages sont ensuite amplifiés et ajoutés à la cible à nouveau. Ce processus d'amplification et incubation est généralement répété plusieurs fois pour augmenter le pourcentage de liaison de phage positif. Bien que des variations de ce procédé ont été largement utilisées pour isoler des anticorps réactifs contre une large gamme d'antigènes cibles, ils nécessitent généralement de grandes quantités d'antigène cible purifiée ^{24,25,26, 27,} alors que notre procédé ne nécessite que des traces de l'antigène cible. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour isoler des réactifs qui antigènes cibles se lient sélectivement qui sont présents à de très faibles concentrations, sans la nécessité d'une purification et le panoramique peut être effectuée directement contre antigène présent dans des échantillons de tissus complexes. L'utilisation de protocoles de panoramique négatifs exhaustives tel que vérifiépar l'AFM assure que clones isolés contre l'antigène positif devraient lier sélectivement la cible, même lorsqu'il ne est pas purifié ou enrichi.

Kasturirangan et ses collègues (2003) ont effectué un processus de biopanning négative et positive similaire visant à isoler des anticorps réagissant à la bêta-amyloïde oligomères en utilisant une concentration de l'ordre du nanogramme de la cible ^5. Ici, nous développons sur ce processus pour permettre la génération de réactifs qui se lient sélectivement la protéine spécifique de la maladie variantes directement à partir des échantillons de tissus humains. Dans les études futures nous avons l'intention d'approfondir non seulement la valeur diagnostique des réactifs isolés ici, mais aussi évaluer leur pertinence thérapeutique pour le traitement de la SLA.

Dans l'ensemble, notre nouvelle technologie à base de bioadhérence AFM devrait être applicable à l'isolement de ne importe quel variant de protéine spécifique de la maladie dans tout matériel biologique sans la nécessité d'une purification ou la modification de protéines, même lorsque l'antigène cible Concentrations sont extrêmement faibles.

Protocol

1. Phage production Effectuer tous les processus de production de phages et biopanning dans une enceinte de sécurité biologique. Produire phages particules des différentes bibliothèques (bibliothèques Tomlinson I et J et fiches bibliothèque 21) pour le processus de biopanning utilisant les instructions du fabricant (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOTE: Nous utilisons plusieurs bibliothèques dans notre processus de panoramique à accroître …

Representative Results

Dans la figure 1, le schéma montre le processus de panoramique négative par laquelle nous avons retiré antigènes hors objectif contraignant de notre bibliothèque à l'aide immunotubes phage. Nous avons commencé avec de la BSA puisque ce est un agent de blocage commun et toute phage qui réagit de manière non spécifique avec cet objectif serait problématique dans les immunoessais futures. Ensuite, nous avons supprimé les liants à agrégée alpha-synucléine pour éliminer phage qui sont r?…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10