루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning
Summary
Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.
Abstract
단백질 변형은 TDP-43 루게릭 병에 (ALS)에서, 알파 – 시누 클레인 등 많은 질환에 중요한 역할을하기 때문에 파킨슨 병 및 알츠하이머 병에서 베타 – 아밀로이드와 타우, 그것은 형태 특정 시약을 선택적으로 타겟팅 할 수 있습니다 개발하는 것이 매우 중요하다 이러한 질병 특정한 단백질은 질병 병리학에 잠재적 인 진단 및 치료 응용 프로그램에 대한 이러한 변형의 역할을 연구하는 변종. 우리는 선택적 질병 특정한 단백질 변이체를 인식 시약의 분리를 가능하게 신규 원자력 현미경 (AFM) 계 biopanning 기술을 개발했다. 프로세스, 음성 및 양성 패닝 단계에 관여하는 두 가지 주요 단계가 있습니다. 네거티브 패닝 단계 동안 오프 – 타겟 항원에 대한 반응성이 파지 엄선 오프 표적 항원을 이용한 서브 트랙 티브 시리즈 패닝 여러 발사를 통해 제거된다. 음의 핵심 기능패닝 단계는 프로세스를 모니터링하고 모든 바람직하지 않은 파지 입자를 제거하는 것을 확인하기 위해 AFM을 이용하여 촬상된다. 포지티브 패닝 위상 관심 표적 항원은 운모 표면에 고정되고 결합 된 파지를 용출 선택적 표적 항원에 결합 된 파지를 식별하기 위해 스크리닝한다. 목적 단백질 변이체는 적절한 네거티브 패닝 제어가 사용되어왔다 제공 정제 할 필요가 없다. 심지어 양의 패닝 단계에서 이용 될 수있는 복잡한 생체 물질은 매우 낮은 농도로 존재하는 유일한 단백질 변이체를 타겟팅. 이 기술의 응용 프로그램을 통해, 우리는 선택적으로 인간의 ALS의 뇌 조직에서 발견되는 TDP-43의 단백질 변형에 대한 항체를 인수했다. 우리는이 프로토콜은 선택적으로 다른 생물학적 과정 및 다양한 질병에 존재하는 단백질 변이체를 생성하는 바인딩 시약에 적용 할 것을 기대한다.
Introduction
단백질 변이체의 존재는 알쯔하이머, 파킨슨, ALS 및 전 측두엽 치매 (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 질환의 진행에 인자로서 연루되어왔다 , 10, 11. 단백질 베타 아밀로이드 및 알파 – 시누 클레인의 올리고머 형태의 알츠하이머와 파킨슨 각각 2,3,4,5에 대한 책임이있는 독성 종 것으로 생각된다. TAR DNA 결합 단백질 43 (TDP-43)의 집계는 ALS와 FTD 12,13,14에 연결되어있다. 따라서 선택적으로 다른 단백질 변종으로 진단 마커 및 잠재적 치료제를 제공 할 수있는 강력한 도구가 될 수 타겟팅 할 수있는 항체와 같은 시약. 이 연구에서 우리는 그러나이 문서에서 설명 된 기술은 제자의 넓은 범위에 대해 시약의 분리에 적용해야한다, 선택적으로 ALS에 연루 TDP-43 단백질의 변형을 결합 시약을 개발에 초점을 맞추고EIN은 변종.
TDP-43의 세포질 집계 ALS 15,16,17,18,19의 병리학 적 기능으로 확인되었습니다. 그것은 세포질과 핵 15,17 사이를 이동하는 경향이 있지만, 일반적으로 TDP-43은 정상인의 모든 세포의 핵에서 발견된다. TDP-43의 그러나 ALS 집계 양식은 질병의 진행 16, 20시 세포질에 핵에서 TDP-43의 움직임을 제안하는 핵에있는 낮은 농도로 선택 신경 세포의 세포질과 아교 세포에서 발견된다. TDP-43의 응집 ALS의 대부분의 경우에서 발견되는 반면, 돌연변이에 연결된 1 % 총 ALS 케이스 (또는 15 % 가족 ALS 사례의 20 %)의 -2 % 보낸 모든 경우를 고려하지 않는다 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 1 (SOD1) 유전자 15,17. 때문에 ALS의 대부분의 경우에 TDP-43의 중요한 역할로, 여기에 우리가 선택적입니다 TDP-43 변형에 결합 할 수 항체 기반의 시약을 개발에 초점우리의 새로운 AFM 기반 biopanning 기술을 이용하여 인간의 ALS의 뇌 조직에 존재.
처음에 우리는 항체 결합 도메인의 다양한 레퍼토리를해야합니다. 우리는 세 가지 다른 파지 디스플레이 단일 쇄 가변 도메인 항체 단편 (scFvs) 라이브러리 (톰린슨 I 및 J 및 시트 라이브러리 21)를 결합했다. 패닝 과정은 음성 및 양성 패닝 단계로 구분된다. 파아지 라이브러리의 첫번째 다수 오프 표적 항원을 제외 반응성 파지되는 동안 음의 패닝 처리가 실시된다. 각 오프 – 타겟 항원에 대한 부정적인 패닝 각 라운드의 종료 후, 처리는 오프 – 타겟 항원 결합 파지 모두가 제거되었는지를 확인하기 위해 AFM 촬상에 의해 모니터링된다. 만 모든 반응 파지가 제거 AFM 이미징에 의해 확인 후 우리는 다음 목표로 진행 않습니다. ALS에 연루 TDP-43 변종 시약을 분리하기 위해 우리는 다음과 같은 부정적인 패닝 항원을 사용 : 1) BSA는 약하게 또는 비특이적 단백질에 결합하는 파지를 제거; 2) 집계 알파 – 시누 클레인 집계 단백질의 일반적인 구조 요소에 결합하는 파지를 제거; 3) 인간의 뇌 조직 균질은 단백질이나 건강한 사람의 뇌 조직의 사후 샘플에 존재하는 다른 구성 요소에 결합하는 파지를 제거; 4) 건강한 사람의 뇌와 관련된 모든 TDP-43 형태로 결합하는 파지를 제거하기 위해 건강한 사람의 뇌에서 TDP-43 면역; 5) TDP-43 비 ALS 병리와 관련된 TDP-43 변종을 결합하는 파지를 제거하기 위해 FTD 뇌 균질에서 격리 면역. 모든 오프 – 타겟 항원에 대한 반응성 모든 파지를 제거한 후에, 우리는 인간 ALS의 뇌 조직에서 면역 침전이 경우 TDP-43, 관심 항원 결합 항체 단편을 단리하는 동안, 포지티브 패닝 단계로 진행. 이러한 고립 된 항체는 TDP-43의 집계 또는 수정 된 형태로 반응 할 수있다.
"> 기존 파지 biopanning가 긍정적 인 패닝 단계 (22, 23)에 주로 초점을 맞추고있다. 일반적으로 관심의 대상이 고정화되어, 파지 라이브러리를 추가하고 바운드 파지.이 증폭 배양 과정을 파지 한 후 증폭된다. 용출 다시 대상에 추가 이 프로세스의 변화가 타겟 항원의 넓은 범위에 대해 항체 시약을 분리하기 위해 광범위하게 사용되었지만, 일반적으로 양성 파지 결합의 비율을 증가시키기 위해 여러 번 반복된다. 그들은 일반적으로 정제 된 표적 항원 24,25,26 다량 필요 우리의 프로세스는 표적 항원 미량 필요 반면. 27 여기에서 설명한 프로토콜은 정제 및 패닝 필요없이 매우 낮은 농도로 존재 선택적 바인딩 대상 항원,에 대해 직접 수행 될 수 시약을 분리하는데 사용될 수있다 복잡한 조직 샘플에 존재하는 항원. 철저한 네거티브 패닝 프로토콜의 사용을 통해 입증AFM에 의해 정제 또는 농축하지 않을 경우 양의 항원에 대해 격리 클론 선택적으로도 대상을 결합하는 것을 보장한다.Kasturirangan 및 동료 (2003)는 타겟 (5)의 나노 그램의 농도를 이용하여 베타 – 아밀로이드 올리고머와 반응하는 항체를 분리하는 유사한 음성 및 양성 biopanning 처리를 실시했다. 여기에서 우리는 선택적으로 질병 특정한 단백질이 인간의 조직 샘플에서 직접 변종 결합 시약의 생성을 사용하려면이 프로세스를 확장합니다. 향후 연구에서 우리는 또한 여기뿐 절연 진단 시약의 값을 조사 할뿐만 아니라, ALS를 치료하기위한 그들의 치료 학적 관련성을 평가하고자.
전반적으로, 우리의 신규 biopanning AFM 기반 기술은, 단백질 정제 또는 변경의 필요성없이 생체 물질에 특이 질병 변이체 단백질의 분리에 적용되어야하는 경우에도 표적 항원 concentratioNS은 매우 낮다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH의 연구비 지원 : R21AG042066. 우리는 화면 캡처 비디오를 만드는 그의 공헌 필립 슐츠에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Tomlinson I and J Libraries | MRC (Cambridge, England) | ||
| Sheets Library | MRC (Cambridge, England) | ||
| 2xYT | BD Sciences | 244020 | |
| Glucose | Amresco | 0188-2.5KG | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | Irritant |
| KM13 Helper Phage | MRC (Cambridge, England) | ||
| Kanamycin | OmniPur | 5880 | Irritant |
| Polyethylene Glycol 8000 | OmniPur | 6510 | Irritant |
| Sodium Chloride | Macron | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Amresco | 0404-1KG | Irritant |
| Potassium Chloride | EMD | PX1405-1 | Irritant |
| Potassium Phosphate Monobasic | Amresco | 0781-500G | Irritant |
| TG1 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Luria-Bertani Agar | EMD | 1.10283.0500 | |
| Bovine Serum Albumin | Amresco | 0332-100G | |
| STEN buffer | Crystalgen Inc. | 33429775 | |
| Immunotubes | Thermo Scientific | 470319 | |
| Mica | Spruce Pine Mica | 24365 | |
| Tween 20 | EMD | ||
| Trypsin | Sigma | T-0303 | Irritant |
| Triethylamine | Sigma | T-0886 | Flammable |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | Irritant |
| DNA Plasmid Prep Kit | qiagen | 27106 | Irritant |
| Non-Fat Milk Powder | Carnation | ||
| 96-Well High Binding ELISA Plate | Costar | 3590 | |
| Anti-M13 HRP | GE Healthcare Life Sciences | 27-9421-01 | |
| ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit | Thermo Scientific | 37074 | |
| Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | |
| A/G Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| HB 2151 Cells | MRC (Cambridge, England) | ||
| Isopropylthiogalactoside | Teknova | 13325 | |
| 9e10 HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Nitrocellulose Membrane | Biorad | 162-0115 | Flammable |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall RC 6+ | |
| Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope | Veeco | ||
| AFM Probes | VistaProbes | T300R-10 |
References
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