שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה
Summary
פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.
Abstract
עצם הוא האתר הנפוץ ביותר של גרורות סרטן השד. למרות שזה מקובל שסרטן השפעות מייקרו-סביבת התנהגות התא, מעט מאוד ידוע על מאפייני סרטן שד תא והתנהגויות בתוך מייקרו-הסביבה המקומית של רקמת עצם אנושית. פיתחנו גישות כדי לעקוב אחר, לכמת ולווסת את תאי סרטן השד אנושיים במייקרו-הסביבה של שברים בתרבית רקמת עצם אנושיים מבודדים מראשי הירך הושלכו הבאים כולל ניתוחי החלפת מפרק ירך. שימוש בתאי סרטן השד מהונדס ללוציפראז ומשופר חלבון פלואורסצנטי ביטוי ירוק (EGFP), אנו יכולים לכמת reproducibly דפוסי הגירה והתפשטות שימוש בהדמית פליטת אור (BLI), אינטראקציות תא מסלול בתוך שברי העצמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולהעריך את תאי שד לאחר קולוניזציה עם cytometry זרימה. היתרונות העיקריים של מודל זה כוללים: 1) microe ילידים, ארכיטקטוני שלם רקמהnvironment הכולל סוגי תאים אנושיים רלוונטיים, ו- 2) גישה ישירה למייקרו-הסביבה, המאפשר כמותית מהירה וניטור איכותי והפרעות של נכסי שד ותאי עצם, התנהגויות ואינטראקציות. מגבלה העיקרית, כיום, היא הכדאיות סופית של שברי הרקמות, אשר מגביל את החלון של מחקר לתרבות לטווח קצר. יישומים של מערכת המודל כוללים מחקר על הביולוגיה הבסיסית של סרטן השד וגידולים ממאירים המבקש עצם אחרים בתוך הנישה גרורתי, ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות למקד ביעילות תאי סרטן השד ברקמות עצם.
Introduction
מייקרו-הסביבה של הגידול להכרה רחבה כקובע קריטי של תאים סרטניים התנהגות במהלך התקדמות סרטן השד גרורתי והתפשטה 1-3. המטרה של השיטה שהוצגה כאן היא להקל על המחקר של תאי סרטן השד במייקרו-הסביבה של רקמת עצם אנושי, האתר השכיח ביותר לגרורות סרטן השד 4-6. עצם מורכב מתאי mineralized ומח 7-9, אשר שניהם נמל תאים וגורמים מופרשים מעורבים בהתקדמות גרורתי 10,11. למרות שימוש נרחב במודלים של עכברי vivo להקל על מחקרים מערכתיים של התהליך גרורתי 12-15, אינטראקציות תא בתוך השלד אינן נגישים לתצפית והפרעות ישירות. מערכות מודל ללימוד וculturing רקמות עצם עכבר ותאי מח העכבר לספק גישה טובה יותר והניבו תובנות רבות לגבי crosstalk ומנגנונים מ 'תאי סרטן שדetastasis של השלד העכברי 16-22. עם זאת, המחקרים הראו כי ייתכן שיש מינים ספציפיים דפוסי osteotropism לרקמת עצם 23,24. דפוסים אלה יכולים לשקף מינים ספציפיים הגלומים הבדלים במאפייני רקמת עצם, הבדלים הנובעים מאוכלוסיות מח העצם שינו בעכברי חיסון לקוי 11, ו / או גיל צעיר יחסית של עכברים המשמש בניסויים, שכולן עשויים גורמים של העצם מייקרו-סביבה.
במבחנה גישות ללימוד תאי סרטן השד בשיתוף תרבויות עצם אנושיות התמקד בדרך כלל על סוגי תאי עצם ספציפיים כגון osteoblasts-נגזר מח עצם או תאי סטרומה מתורבתים כמו monolayers או בתוך מערכות מודל 3 ממדים מהונדסים 25-35. למרות שמודלי תרבית תאים 2 ממדים יצרו עמוד התווך של במבחנה גישות לחקר סרטן, זה כבר זמן רב הכיר בכך שהתנהגות התא משתנה מן היסוד במ 'onolayer מערכות תרבות 18,36,37. זה הוביל לפיתוח של מייקרו-סביבות מהונדסות המחקות את המורכבות של רקמות חיות 3 ממדים, כולל מטריצה ומודלים מבוססי פיגום המורכב מחומרים טבעיים כמו קולגן, או פולימרים סינטטיים שנזרעו עם סוגי תאים מסוימים ליצירת מייקרו-סביבות כמו רקמה- 36-41. גם גישות מהונדסות כללו שימוש בפלטפורמות bioreactor לשלוט וללמוד את הסביבה ההורמונלית של מייקרו-הסביבה 18,19,41-43. למרות שמודלים וbioreactors biomimetic לספק אלמנטים רבים של מייקרו-סביבת רקמה מורכבת בסביבה מבוקרת, ויושמו בהצלחה על מנת לקדם את המחקר של גרורות סרטן השד לעצם 18,19,35,42,43, מערכות מודל מהונדסות בדרך כלל אינן לשלב הספקטרום המלא של סוגי תאים ורכיבי מטריצה תאיים הנוכחיים בסביבת עצם הילידים.
עד לאחרונה, סרטן השדתאים לא נחקרו במייקרו-הסביבה המקומית, שלם, 3 ממדים של רקמות עצם אנושיות. לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של מודל שיתוף תרבות באמצעות שברי רקמה אנושיים עצם מבודד מסך החלפת מפרק ירך ניתוח (THR) דגימות 44. דגימות אלה נמל שני תאי mineralized ומח הצורך ללמוד מנגנוני מיקרו-גרורות בתרבות טווח קצרה. בעבודה קודמת הקמנו הוכחה של עיקרון לשימוש בהדמית פליטת אור (BLI) כדי לפקח על ההתפשטות של תאים (מד"א MB-231-fLuc) שיתוף תרבותי עם שברי עצמות 44 להביע לוציפראז סרטן השד. כאן אנו מציגים מפורטים פרוטוקולי ניסוי ללימוד התפשטות תאי סרטן שד, קולוניזציה, והגירה בהקשר של מייקרו-הסביבה המקומית באמצעות explants רקמת עצם אנושי.
ראשית אנו מציגים פרוטוקול לתאי סרטן שד שיתוף culturing סמוכים לברי עצמות למדוד שדהתפשטות תאים באמצעות BLI. בסעיף זה, השעיות תא שד הם זורעים ככתמי תא 6 צלחות גם בסמוך לברי עצמות, שהם משותקים על ידי חתיכות של שעוות עצם. בארות בקרה מכילות שעוות עצם, אך לא שבר עצם. ברגע שכתמי תא לצרף, בינוני הוא הוסיף את הצלחת היא בתרבית למשך 24 שעות, לאחר שעוצמת אות bioluminescent (הקשורים במספר תא) נמדדת עם BLI. בשלב הבא אנו מציגים שיטות לתאי סרטן שד culturing-שיתוף זרע ישירות על גבי שברי עצמות ללמוד קולוניזציה ושגשוג. כאן השעיות תא השד pipetted ישירות על גבי שברי רקמת העצם, שנמצאים תחת פיקוח בתרבות על ידי BLI ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן כדי לעקוב אחר קולוניזציה ומספר תא. בשיטה זו, תא מוח יכול להיות סמוק מברי עצמות בכל נקודה לניתוח של תאי סרטן השד יישבו על ידי זרימת זמן cytometry, או מבחני כדאיות מח.
בנוסף, אנו מבטליםסופר שתי גישות שונות למדידת נדידת תאי סרטן השד. בשיטה הראשונה צעדים מפורטים למדידת הגירה כלפי supernatants תרבית רקמת עצם. בפרוטוקול זה תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים הפנימיים, העליונים של Transwell להכניס קרומים עם גודל נקבובית 8 מיקרומטר (כפי שמוצגים באיור 1 א). לאחר מכן מוסיף ממוקמים לתוך צלחת מקלט עם בארות המכילות supernatant רקמת עצם או בינוני שליטה. במהלך תקופת דגירה 20 שעות, מספר קטן של תאי סרטן השד להעביר דרך הממברנות להכניס לתוך בארות תרבית הרקמה הנמוכות שבו הם מייחסים לגילוי על ידי BLI. בשיטה השנייה הגירת תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים התחתונים, החיצוניים של קרומים להוסיף Transwell. שברי רקמת עצם ממוקמים לתוך הכוסות להוסיף ותאי סרטן השד להעביר דרך ממברנות ליישב את שברי עצמות (כפי שמוצגים באיור 1), שלאחר מכן צילם באמצעות BLI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehra et al. תיאר בעבר את אוסף הנתיחה שלאחר המוות וניתוח של דגימות עצם של חולי סרטן ערמונית גרורתי שנקטפו בעת הנתיחה שלאחר המוות, חושף רקמות באיכות גבוהות ואימות של השימוש בדגימות עצמות אדם ללמוד את התהליך גרורתי 47. כאן יש לנו תארנו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד ושימ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקרים אלו מומנו, בין שאר, על ידי מענקים מהאלטרנטיביים למחקר ופיתוח (107,588), המכון הלאומי לבריאות (1U54CA136465-04S1), ותכנית לחקר סרטן שד קליפורניה (201B-0141). אנו מודים בני הזוג. אנדרו וילבר ור 'סקוט McIvor לתרומתם הנדיבה שלהם פלסמידים transposase transponson וPK / hUbiC-SB11. הכרת תודה אנו מודים ג'ון Tamaresis, Ph.D. לקבלת ייעוץ על שיטות סטטיסטיות, טימותי בראון לביצוע cytometry זרימה, ג'ורג'ט היינריך לקבלת ייעוץ על מבחני הגירה, וננסי Bellagamba להקלה על האוסף של דגימות THR.
Materials
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an ‘all human’ animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients’ bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
