Методы культивирования бедренной кости человека тканевых эксплантов для изучения клеток рака молочной железы колонизации метастатического ниши

Summary

Протоколы описаны для изучения миграции клеток рака молочной железы, пролиферации и колонизации в костной ткани системе эксплантов модели человека.

Abstract

Кость является наиболее распространенным сайт метастазов рака молочной железы. Хотя широко признается, что поведение рака микроокружение влияет клеток, мало что известно о свойствах клеток рака молочной железы и поведения внутри родной микроокружения костной ткани человека. Мы разработали подходы для отслеживания, количественной оценки и модулируют человека клеток рака молочной железы в микросреде культурные фрагменты костной ткани человека, выделенные из выброшенных головки бедра после тотальной операции по замене тазобедренного сустава. Использование клеток рака молочной железы разработаны для люциферазы и усовершенствованные зеленый флуоресцентный белок (EGFP) выражение, мы можем воспроизводимо количественно миграции и пролиферации моделей с использованием изображений биолюминесценции (BLI), отслеживать клеточные взаимодействия в костных фрагментов с помощью флуоресцентной микроскопии и оценки клетки груди после колонизация проточной цитометрии. Основные преимущества этой модели включают в себя: 1) родной, архитектурно неповрежденной ткани microenvironment который включает в себя соответствующие виды клеток человека, и 2) прямой доступ к микросреде, что облегчает быстрый количественный и качественный мониторинг и возмущение молочной железы и костных клеток свойств, поведения и взаимодействия. Основным ограничением, в настоящее время, является конечным жизнеспособность фрагментов ткани, которая ограничивает окно исследования в краткосрочной культуры. Применение модели системы включают в себя изучение фундаментальной биологии рака молочной железы и других злокачественных опухолей костей, ищущих в метастатической ниши, а также разработка терапевтических стратегий для создания более эффективных адресных клеток рака молочной железы в костной ткани.

Introduction

Микросреда опухоли широко признается одним из важнейших факторов поведения раковых клеток во время прогрессирования рака молочной железы и метастазов ^1-3. Цель метода, представленного здесь, чтобы облегчить изучение клеток рака молочной железы в микросреде человек костной ткани, наиболее частым местом рака молочной железы метастаз ^4-6. Кость состоит из минерализованных и мозга отсеков ^7-9, оба из которых укрывают клетки и секретируемые факторов, обуславливающих метастатического прогрессирования ^10,11. Хотя широко используется в естественных условиях мышиных моделях облегчить системные исследования метастатического процесса ^12-15, сотовые взаимодействия в скелете не легко доступны для наблюдения и прямого возмущения. Модельные системы для изучения и культивирования мыши костной ткани и клетки мыши мозга обеспечения лучшего доступа и дали много интересных идей относительно перекрестных помех и механизмы, лежащие в основе раковых клеток молочной железы мetastasis мышиного скелета ^16-22. Тем не менее, исследования показали, что там может быть видоспецифичные модели osteotropism для костной ткани ^23,24. Эти модели могут отражать присущие конкретным видам различия в свойствах костной ткани, различия, вытекающие из измененных населения костного мозга в иммунном-дефицитных мышей ^11, и / или относительно молодой возраст мышей, используемых в экспериментах, все из которых, вероятно, детерминанты кости микросреда.

В пробирке подходы для изучения клеток рака молочной железы в кости человека сокультурах, как правило, сосредоточены на конкретных типов костных клеток, таких как мозга, полученных остеобластов или стромальных клеток, культивируемых в виде монослоев или внутри инженерных 3-мерной модели систем ^25-35. Хотя модели 2-мерных клеток культуры сформировали оплот в пробирке подходы для исследования рака, она уже давно признано, что поведение клеток в корне изменило в мonolayer культуры систем ^18,36,37. Это привело к разработке инженерных микросреды, которые имитируют сложность 3-мерных живых тканей, в том числе и матричным моделей лесов на основе составленных из натуральных материалов, таких как коллаген или синтетические полимеры высевают с определенными типами клеток, чтобы создать подобные ткани микросреды ^36-41. Инженерные подходы были также включали в себя использование биореактора платформ для управления и изучения гормональной среды микроокружения ^18,19,41-43. Хотя биомиметические модели и биореакторы обеспечивают многие элементы сложной ткани микросреды в контролируемых условиях, и успешно применяется для дальнейшего изучения рака молочной железы метастазы в кости ^{18,19,35,42,43,} инженерные системы модели обычно не включают Полный спектр типов клеток и компонентов внеклеточного матрикса, присутствующих в природном окружении кости.

До недавнего времени, рак молочной железыклетки не были изучены в родном, неповрежденной, 3-мерной микроокружения тканей кости человека. Мы недавно сообщили о разработке модели сокультуры с использованием человеческих фрагментов ткани костей, выделенных из тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (THR) хирургии образцов ^44. Эти образцы гавани и минерализованных и мозга отсеков, необходимые для изучения механизмов, лежащих в основе микро-метастазы в короткий срок культуры. В предыдущей работе мы установили чек, подтверждающий принципе для использования биолюминесценции томография (BLI), чтобы следить за распространением люциферазы выражения раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231-fLuc) совместно культивировали с костными фрагментами ^44. Здесь мы представляем подробные экспериментальные протоколы для изучения распространения клеток молочной железы рак, колонизации и миграции в контексте родного микросреды, используя ткани эксплантов человеческой кости.

Сначала мы приводим протокол для совместного культивирования клеток рака молочной железы, прилегающих к костных фрагментов для измерения грудьпролиферации клеток с использованием BLI. В этом разделе, молочной суспензии клеток высевают в клеточных мест в 6-луночных планшетах, прилегающих к костных фрагментов, которые иммобилизованных на куски кости воска. Контрольные лунки содержат костный воск, но не костного фрагмента. После того, как сотовые пятна прикрепить, добавляли среду и пластины культивируют в течение 24 ч, после чего интенсивность биолюминесцентного сигнала (связанный с числом клеток) измеряется с ОУИ. В следующем шаге мы представляем методы для совместного культивирования клеток рака молочной железы, посеянных прямо на костных фрагментов для изучения колонизации и распространения. Здесь молочной клеточные суспензии пипеткой непосредственно на фрагменты тканей костей, которые контролируются в культуре BLI и флуоресцентной микроскопии с течением времени для отслеживания колонизации и количество клеток. В этом способе костный мозг отсека может быть промыта от костных фрагментов в любой момент времени для анализа колонизировали клеток рака молочной железы с помощью проточной цитометрии, или жизнеспособности мозга анализы.

Кроме того, мы деписец два различных подхода для измерения миграции клеток рака молочной железы. В первом способе шаги описаны для измерения миграции к костной ткани культуральных супернатантах. В этом протоколе клеток рака молочной железы высевают на внутреннюю, верхние поверхности Transwell вставки мембраны с размером пор 8 мкм (как показано на фиг.1А). Вставки затем помещают в приемник пластины с лунки, содержащие ткани супернатант кости или контрольной среде. В течение периода инкубации 20 ч, небольшое количество раковых клеток молочной железы мигрируют через вставку мембраны в нижнюю тканевых культур скважин, где они прикрепляются для обнаружения по BLI. Во втором способе миграции клеток рака молочной железы высевают на нижних, наружных поверхностей Transwell вставки мембран. Фрагменты костной ткани помещаются во вставку чашек и клетки рака молочной железы мигрируют через мембраны колонизировать костных фрагментов (как показано на рисунке 1б), чтоЗатем отображаемого использованием BLI.

Protocol

Головок бедренных костей были собраны из пациентов выборные THR операции в отделения ортопедической хирургии в Стэнфордском университете в Школе медицины. Все ткани были собраны в обезличенной образцов в соответствии с правилами Управления Стэнфордского университета научно-исследовательского …

Representative Results

Изоляция Tissue фрагментов из головок бедренных костей Головок бедренных костей были собраны из равного числа мужчин и у женщин (44-90 лет), перенесших плановое общее операцию эндопротезирования тазобедренного в отделения ортопедической хирургии в Стэнфордском университе?…

Discussion

Мехра и др. Ранее описано сбор и анализ образцов костных посмертных от пациентов с метастатическим раком простаты, собранных во время вскрытия, показывая высокие ткани качества и проверки использования образцов кости человека для изучения метастатического процесса ^47. Здес?…

Materials

DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)