Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique
Summary
Les protocoles sont décrits pour l'étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d'expiant de tissu osseux humain.
Abstract
L'os est le site le plus courant de métastase de cancer du sein. Même se il est largement admis que le comportement cellulaire influences microenvironnement de cancer, on en sait peu sur les propriétés et comportements de cellules de cancer du sein dans le microenvironnement natif du tissu osseux humain. Nous avons développé des approches pour suivre, de quantifier et de moduler les cellules cancéreuses du sein humain dans le microenvironnement de fragments humains en culture de tissus osseux isolés à partir de têtes fémorales rebut suivants arthroplasties totales de la hanche. En utilisant des cellules de cancer du sein d'ingénierie pour la luciférase et améliorés protéine fluorescente (EGFP) expression vert, nous sommes en mesure de quantifier de façon reproductible les schémas de migration et de prolifération utilisant l'imagerie par bioluminescence (BLI), les interactions cellulaires de piste dans les fragments d'os en utilisant la microscopie de fluorescence, et d'évaluer les cellules mammaires après colonisation par cytométrie de flux. Les principaux avantages de ce modèle sont les suivants: 1) un MicroE de tissu natif, l'architecture intactenvironnement qui comprend les types pertinents de cellules humaines, et 2) l'accès direct à la micro, ce qui facilite quantitative rapide et suivi qualitatif et la perturbation du sein et de cellules osseuses propriétés, les comportements et interactions. Une limitation principale, à l'heure actuelle, la viabilité est finie de fragments de tissus, qui confine la fenêtre d'études de culture à court terme. Les applications du système de modèle comprennent l'étude de la biologie fondamentale du cancer du sein et d'autres tumeurs malignes ostéotropes l'intérieur de la niche métastatique, et le développement de stratégies thérapeutiques pour cibler efficacement les cellules de cancer du sein dans les tissus osseux.
Introduction
Le microenvironnement tumoral est largement reconnue comme un facteur déterminant du comportement des cellules cancéreuses lors de la progression du cancer du sein métastatique et réparties 1-3. Le but de la méthode présentée ici est de faciliter l'étude des cellules de cancer du sein dans le microenvironnement du tissu osseux humain, le site le plus fréquent des métastases du cancer du sein 06/04. L'os est constitué de compartiments minéralisées et moelle 7-9, qui abritent les deux cellules et les facteurs sécrétés impliqués dans la progression métastatique 10,11. Bien que largement utilisé dans des modèles murins in vivo faciliter les études systémiques du processus métastatique 12-15, interactions cellulaires dans le squelette ne sont pas facilement accessibles pour l'observation et la perturbation directe. systèmes de modèle pour l'étude et la culture de tissus osseux de la souris et des cellules de moelle de souris fournissent un meilleur accès et ont donné de nombreuses idées concernant la diaphonie et les mécanismes sous-jacents cellules du cancer du sein metastasis du squelette murin 16-22. Cependant, des études ont suggéré qu'il pourrait y avoir des motifs spécifiques aux espèces de ostéotropisme pour le tissu osseux 23,24. Ces modèles pourraient refléter espèces spécifiques inhérents différences dans les propriétés du tissu osseux, les différences résultant de populations de moelle osseuse altérées chez des souris immunodéficientes 11, et / ou l'âge relativement jeune de souris utilisés dans des expériences, qui sont tous des déterminants probables de l'os microenvironnement.
Approches in vitro pour étudier les cellules du cancer du sein dans l'os co-cultures humaines ont généralement porté sur des types de cellules osseuses spécifiques tels que les ostéoblastes dérivées de la moelle ou de cellules stromales cultivées en monocouches ou dans des systèmes modèles en 3 dimensions modifiées 25-35. Bien que les modèles de culture cellulaires deux dimensions ont formé le pilier de approches in vitro pour la recherche sur le cancer, il est reconnu depuis longtemps que le comportement de la cellule est fondamentalement modifiée en monolayer systèmes de culture 18,36,37. Cela a conduit au développement de micro-environnements modifiés qui imitent la complexité des tissus vivants trois dimensions, y compris matriciel et modèles basés échafaudage sont constitués de matières naturelles, telles que le collagène, ou des polymères synthétiques ensemencées avec des types de cellules spécifiques pour créer des micro-environnements de tissu ressemblant 36-41. Les approches d'ingénierie ont également inclus l'utilisation de plates-formes de bioréacteurs pour contrôler et étudier le milieu hormonal du microenvironnement 18,19,41-43. Bien que les modèles et les bioréacteurs biomimétiques fournissent de nombreux éléments d'un microenvironnement des tissus complexes dans un environnement contrôlé, et ont été appliquées avec succès pour faire progresser l'étude des métastases du cancer du sein à l'os 18,19,35,42,43, systèmes modèles d'ingénierie ne intègrent généralement pas la gamme complète de types de cellules et de composants de la matrice extracellulaire présents dans l'environnement de l'os natif.
Jusqu'à récemment, le cancer du seincellules ne ont pas été étudiés dans le, intacte microenvironnement natif, trois dimensions des tissus osseux humains. Nous avons récemment rapporté le développement d'un modèle de co-culture en utilisant des fragments de tissus osseux humains isolés à partir de prothèse totale de hanche (PTH) Chirurgie spécimens 44. Ces spécimens abritent les deux compartiments minéralisées et de moelle osseuse nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents de micro-métastases dans la culture à court terme. Dans des travaux antérieurs, nous avons établi la preuve de principe pour l'utilisation de l'imagerie par bioluminescence (BLI) de surveiller la prolifération des cellules du cancer du sein exprimant la luciférase (MDA-MB-231-Fluc) co-cultivées avec des fragments d'os 44. Ici, nous présentons détaillons protocoles expérimentaux pour étudier la prolifération des cellules du cancer du sein, de la colonisation et de la migration dans le contexte du microenvironnement natif utilisant des explants de tissus osseux humain.
Nous présentons d'abord un protocole de cellules de cancer du sein co-culture adjacents à des fragments d'os pour mesurer seinla prolifération cellulaire en utilisant BLI. Dans cette section, des suspensions de cellules du sein sont ensemencées sous forme de taches de cellules dans des plaques à 6 puits adjacents à des fragments d'os, qui sont immobilisées par des morceaux de cire osseuse. Les puits témoins contiennent de la cire d'os, mais pas de fragment d'os. Une fois les taches de cellules attachent, milieu est ajouté et la plaque est mise en culture pendant 24 heures, après quoi l'intensité du signal bioluminescent (associée avec le nombre de cellules) est mesuré avec BLI. Dans l'étape suivante, nous présentons des procédés pour les cellules cancéreuses du sein co-culture ensemencés directement sur les fragments d'os à étudier la colonisation et la prolifération. Ici, les suspensions de cellules du sein sont déposés à la pipette directement sur les fragments de tissus osseux, qui sont suivis dans la culture par BLI et la microscopie de fluorescence au cours du temps pour suivre la colonisation et le nombre de cellules. Dans ce procédé, le compartiment de moelle peut être envoyé à partir des fragments d'os à ne importe quel point dans le temps pour l'analyse de cellules du cancer du sein colonisés par cytométrie en flux, ou des dosages de viabilité de la moelle osseuse.
En outre, on describe deux approches différentes pour la mesure de la migration des cellules du cancer du sein. Dans la première méthode étapes sont décrites pour mesurer la migration vers les tissus osseux surnageants de culture. Dans ce protocole, les cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces supérieures intérieures, d'insérer des membranes Transwell avec une taille de pores de 8 um (comme représenté sur la figure 1A). Les inserts sont ensuite placés dans une plaque de réception avec des puits contenant des tissus osseux surnageant ou le milieu de contrôle. Au cours d'une période d'incubation de 20 h, un petit nombre de cellules cancéreuses du sein migrent à travers les membranes d'insertion vers le bas dans les puits de culture de tissus inférieurs où ils se fixent pour la détection par BLI. Dans la seconde méthode de migration des cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces extérieures inférieures, de membranes d'insert Transwell. des fragments de tissu osseux sont placées dans les cupules d'insertion et les cellules de cancer du sein migrent à travers les membranes à coloniser les fragments d'os (comme représenté sur la figure 1B), quisont ensuite imagé en utilisant BLI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehra et al. Ont déjà décrit la collecte et l'analyse des échantillons d'os post-mortem de patients métastatiques de cancer de la prostate récoltés au moment de l'autopsie, révélant des tissus de haute qualité et de valider l'utilisation des échantillons d'os humains pour étudier le processus métastatique 47. Ici, nous avons décrit les protocoles pour la collecte, le traitement et l'utilisation de fragments de tissus osseux humains obtenus à partir de têtes fé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces études ont été financées, en partie, par des subventions de la Fondation Alternative recherche et développement (107 588), l'Institut national de la santé (1U54CA136465-04S1), et le Programme de recherche sur le cancer du sein en Californie (201B-0141). Nous remercions les Drs. Andrew Wilber et R. Scott McIvor pour le don généreux de leur transponson et PK / Hubic-SB11 plasmides de transposase. Nous tenons à remercier John Tamaresis, Ph.D. pour obtenir des conseils sur les méthodes statistiques, Timothy Brown pour effectuer cytométrie de flux, Georgette Henrich pour obtenir des conseils sur les migrations des essais, et Nancy Bellagamba pour faciliter la collecte de spécimens THR.
Materials
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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