Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Spezialisierten Immunzellen, die Tumorumgebung infiltrieren regulieren das Wachstum und Überleben von Neoplasie. Maligne Zellen müssen entziehen oder zu untergraben Anti-Tumor-Immunantwort, um zu überleben und zu gedeihen. Tumoren profitieren Sie von einer Reihe von verschiedenen Mechanismen der Immun "Escape", einschließlich der Rekrutierung von tolerogenen DC, immunsuppressive regulatorischen T-Zellen (Tregs) und myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), die zytotoxische Antitumor-Reaktionen hemmen. Umgekehrt können Anti-Tumor-Effektor Immunzellen das Wachstum und die Ausdehnung von malignen Erkrankungen verlangsamen: immunstimulatorische dendritische Zellen, natürliche Killerzellen, die angeborenen Tumorimmunität beherbergen, und zytotoxischen T-Zellen alle in der Tumorsuppression beteiligt. Die Balance zwischen pro- und anti-Tumor-Leukozyten letztlich bestimmt das Verhalten und das Schicksal der transformierten Zellen; eine Vielzahl von klinischen Studien am Menschen haben dies getragen heraus. Somit detaillierte Analyse Leukozytenuntergruppen innerhalbder Tumor-Mikroumgebung ist zunehmend wichtig geworden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Analyse infiltrierenden Leukozyten im Tumormikromilieu in einem Maus-Tumormodell vorhandenen Teilmengen. Maus-B16-Melanomtumorzellen wurden subkutan in C57BL / 6-Mäuse inokuliert. Zu einem bestimmten Zeitpunkt, wurden Tumoren und der umgebenden Haut en bloc reseziert und in Einzelzellsuspensionen, die dann für die Multi-Farb wurden Durchflusszytometrie verarbeitet. Mit einer Vielzahl von Leukozyten-Untergruppe Marker, konnten wir die relativen Prozentsätze der zu infiltrieren Leukozyten-Untergruppen zwischen Kontrolle und Chemerin-exprimierenden Tumoren zu vergleichen. Forscher kann ein solches Werkzeug zu verwenden, um die Immun Anwesenheit im Tumor-Mikroumgebung und als mit herkömmlichen Sattelgrößenmessungen von Tumorwachstum in Verbindung, wird möglicherweise damit sie die Auswirkungen von Veränderungen der Immunzusammensetzung auf das Tumorwachstum zu erhellen studieren. Eine solche Technik kann auf jede Tumormodell angewendet werden, in dem der Tumor und seiner Mikro cein reseziert und verarbeitet werden.
Introduction
Die Balance zwischen Tumorwachstum und die Förderung und Regression ist, teilweise abhängig von der Balance zwischen pro- und anti-Tumor-infiltrierenden in der Mikroumgebung 1,2 vorhanden Leukozyten. Um die Tumorumgebung zu studieren (TME) und spezifisch identifizieren infiltrierenden Leukozyten-Subpopulationen, ein Verfahren zur Auswertung von subkutanen Tumoren entwickelten wir in einem Mäusetumormodell. Die Bedeutung der Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung ist gut bekannt und in der Literatur gestützt. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Gleichgewicht von pro- und anti-Tumor-infiltrierenden Immunzellen können die Ergebnisse der das Tumorwachstum nicht nur in der Maus, sondern auch Studien am Menschen (in 3,4 prüft) auswirken. B. Curiel et al. Zeigten, dass verschlechterten klinischen Ergebnisse bei Eierstockkrebspatienten wurden mit der Anwesenheit von steigenden Prozent tumorinfiltrierender regulatorischen CD4 + T-Zellen (Treg) 5 korreliert. Unsere eigene Arbeit zeigte auch die Wirkung eines nichtvel Leukozyten Chemolockstoff auf dem Verhältnis der Leukozyten-Untergruppen in einem Maus-Melanom-Modell 6, die ebenfalls korreliert mit verringerten Tumorwachstum. Somit werden die detaillierten Analysen der Leukozyten-Untergruppen innerhalb eines Tumors nun allgemein anerkannt und mehr an Bedeutung.
Es gibt viele Möglichkeiten, um die Tumor-Mikroumgebung für das infiltrierende Leukozyten zu bewerten; zB Gruppen transgenen Mäusen entwickelt, um verschiedene fluoreszierende Proteine, um Bild die TME 7, klassische Immunhistochemie und Immunfluoreszenz der erhaltenen Abschnitte 8, einschließlich der verschiedenen bildgebenden Verfahren wie MRI, PET, konfokale Mikroskopie 9-11 Ausdruck bringen – einige mit der Möglichkeit, intravital 10,12 überwachen. Diese können mit verschiedenen molekularen Bildgebungsmittel, wie Nanopartikel 13 oder neuartige Kontrastmittel 14, die Immunzellen Etikett verwendet werden. Unsere Methode ist eine Durchflusszytometrie-basierten Ansatz und hat mehrere Vorteile.Erstens kann der gesamte Tumor-Mikro abgetastet werden; bei der Analyse wird das gesamte subkutane Tumor und dem umgebenden Peripherie operativ zum Verarbeiten reseziert. Dies beseitigt jegliche potentiell Abtasten Bias innerhalb eines einzigen Tumor und gibt eine "globale" Analyse des Tumors als Ganzes. Zweitens, mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie, um die Leukozyten-Untergruppen analysieren, ermöglicht es uns, genauer zu messen den Phänotyp infiltrieren Leukozyten. Abhängig von der Anzahl der verwendeten Farben können sehr spezifische Untergruppen identifiziert werden. Dies ist wichtig, da es mehrere Leukozyten-Untergruppen in einem bestimmten Zelltyp – oder gar in einem allgemeinen Untertyp Klassifizierung – die unterschiedlichen Funktionen, die bei der Bestimmung des Schicksals des Tumors potenziell signifikante sind zu haben. Zum Beispiel haben plasmacytoid dendritischen Zellen (PDC) in Tumorimmunität 15 in Verbindung gebracht. Jedoch ist die CCR9 + Untergruppe von pDCs wurde gezeigt tolerogenen 16 sein, und Verschieben des baLanze einer solchen Untergruppe kann einen Einfluss auf das Tumorwachstum.
Unsere Methode ist für die subkutane oder andere Tumoren, die en bloc reseziert werden können, geeignet. In unseren Händen, wurden Tumoren einheitlich zum Zeitpunkt der Euthanasie reseziert. Jedoch ist es denkbar, wie in einigen Studien durchgeführt worden, daß eine subkutane Tumor konnte vollständig Verschluss der umgebenden Haut in einem Überlebens Operation 17 reseziert werden, was eine zusätzliche Auswertung des Tieres. Die Analyse wird dann an der resezierten Tumorgeführt. So sind die Ergebnisse stellen einen einzigen Zeitpunkt in der Entwicklung des Tumors. Während dies ermöglicht einen detaillierten Einblick in die Mikroumgebung, es ist auch ein statisches Bild von dem, was ist ohne Zweifel ein dynamischer Prozess. Jedoch isolierten Leukozyten (zB über magnetische Trennung oder Dichtegradientenzentrifugation) können dann separat von der Tumor Epithel und Stroma analysiert werden, oder in anderen, funktionelle Assays verwendet werden, um ihr Erscheinungsbild weiter zu definieren, wie bereits Previ hatlaufend beschrieben 18. Dieses Verfahren wäre dann nützlich irgendeinem Forscher interessiert die Analyse der Zusammensetzung der Leukozyten innerhalb der Tumormikroumgebung zu einem gegebenen Zeitpunkt zu sein, ob die Einstellung des natürlichen Krankheitsverlaufs oder nach einer bestimmten therapeutischen Störung. Obwohl nicht von uns durchgeführt, könnte Variationen dieses Verfahrens möglicherweise auch verwendet, um bestimmte Abschnitte eines Tumors in Isolation zu analysieren. Beispielsweise in Anbetracht der Größe des Tumors, die Randzone (n) kann von der zentralen, ggf. nekrotischen Kern des Tumors präpariert eine räumlich getrennte Ansicht der Tumor-Mikroumgebung, die Forscher zu ergeben.
In dem aufstrebenden Gebiet der Tumorimmunologie, gibt es keinen Zweifel, eine exponentiell wachsende Anzahl von Studien zur Bewertung neuartiger immunmodulatorischer Wirkstoffe in murinen Tumormodellen sein. Mehrere Berichte haben die Unterschiede in bestimmten Leukozyten-Funktion innerhalb des Tumors gegenüber dem peripheren en hervorgehobenUmwelt. Beispielsweise Shafer-Weaver et al. Zeigten, in einem Mausmodell, das Antigen-spezifischen T-Effektorzellen CD8 + Zellen, während in der Peripherie aktiv, wurden in CD8 + T-Suppressor-Zellen umgewandelt werden, wenn sie in die Tumorumgebung 19 verschleppt. Dies war teilweise auf TGFß, aber andere Faktoren sind wahrscheinlich ebenso beteiligt. Somit Auswerten Leukozytenuntergruppen – Zahlen und Verhältnisse sowie Funktionszustand – im Tumor selbst wird eine genauere Darstellung der Wirkung eines bestimmten Immunmodulation auf Tumor Schicksal.
Unsere Technik erlaubt eine detaillierte Analyse des Tumors und stellt dem Forscher die Möglichkeit, Veränderungen in der Leukozyten-Populationen als frühere Ansätze genauer identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Darstellende detaillierte Analyse der Tumor-Mikroumgebung ist kritisch bei der Bestimmung der Mechanismen und Wirkungen der Immunmodulation. Mit der zunehmenden Anwesenheit von Immuntherapeutika in der menschlichen klinischen Bereich, das Verständnis der Auswirkungen dieser Mittel auf die Tumor-infiltrierenden Leukozyten immer erforderliche in ihrem Wirkmechanismus definieren. Beim Menschen gibt oft existieren klinische und / oder logistischen Schwierigkeiten bei der Beschaffung und Analyse von Tumorgewebe für die Leu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01-CA169354 unterstützt und R01-047822 von den National Institutes of Health und Merit Award aus dem Department of Veterans Affairs (EZB). RKP wurde vom NIH T32 CA009287-30A1, einem ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship, und ein American Cancer Society Mentorierte Forschung Scholar Grants unterstützt; BAZ wurde vom NIH Zuschusses AI079320 unterstützt. JM wurde von Stipendien von NIH T-32 Ausbildungsförderung T32-AI07290- 25. T32-AI07290-24 und American Cancer Society Post-Doc-Stipendium PF-12-052-01-CSM unterstützt.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
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