Avaliação do tumor infiltrantes Leucócitos Subconjuntos em um modelo de tumor subcutâneo
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Células imunitárias especializadas que se infiltram no microambiente tumoral regulam o crescimento e sobrevivência de neoplasia. As células malignas deve iludir ou subverter as respostas imunes anti-tumorais, a fim de sobreviver e prosperar. Tumores tirar vantagem de uma série de diferentes mecanismos de imune "fuga", incluindo o recrutamento de tolerogénico DC, as células T reguladoras imunossupressores (Tregs), e células supressoras derivadas de mielóides (MDSC) que inibem as respostas anti-tumorais citotóxicos. Por outro lado, as células efectoras imunes anti-tumor pode retardar o crescimento e expansão de tumores malignos: células dendríticas imunoestimulantes, células natural killer, que abrigam a imunidade anti-tumoral inato, e células T citotóxicas todos podem participar na supressão tumoral. O equilíbrio entre pró e anti-tumorais leucócitos última análise, determina o comportamento e destino das células transformadas; uma série de estudos clínicos humanos deram isso. Assim, a análise detalhada de subconjuntos de leucócitos dentroo microambiente do tumor tornou-se cada vez mais importante. Aqui, nós descrevemos um método para a análise de subconjuntos de leucócitos que se infiltram presentes no microambiente tumoral num modelo de tumor de rato. Células tumorais de melanoma B16 de rato foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos C57BL / 6. Em um determinado momento, tumores e pele circundante foram ressecados em bloco e transformadas em suspensões de células individuais, que foram então coradas para multi-color citometria de fluxo. Usando uma variedade de marcadores de leucócitos subconjunto, fomos capazes de comparar as percentagens relativas de se infiltrar em subconjuntos de leucócitos entre controle e tumores que expressam chemerin. Os investigadores podem usar essa ferramenta para estudar a presença imune no microambiente do tumor e quando combinado com medidas de tamanho calibre tradicionais de crescimento do tumor, irá potencialmente permitir-lhes para elucidar o impacto das mudanças na composição imune no crescimento do tumor. Uma tal técnica pode ser aplicada a qualquer modelo de tumor em que o tumor e o seu microambiente cum ser ressecado e processado.
Introduction
O equilíbrio entre o crescimento do tumor e de promoção de regressão é, em parte, dependente do balanço de leucócitos tumor infiltrando pró e anti-presentes no microambiente 1,2. A fim de estudar o microambiente tumoral (TME) e especificamente identificar as subpopulações de leucócitos infiltrantes, foi desenvolvido um método para a avaliação dos tumores subcutâneos em um modelo de tumor de murino. A importância de se estudar o microambiente do tumor é bem conhecido e apoiado na literatura. Numerosos estudos têm mostrado que o equilíbrio de pro- e anti-tumorais infiltrado de células imunitárias pode ter impacto nos resultados do crescimento do tumor, não só no rato, mas também estudos com seres humanos (revisto em 3,4). Por exemplo, Curiel et ai. Mostraram que pioraram os resultados clínicos em pacientes com cancro do ovário foram correlacionados com a presença de percentagens crescentes de células infiltrantes tumorais reguladoras T CD4 + (Tregs) 5. O nosso próprio trabalho também mostrou o efeito de um nãovel de leucócitos quimioatraente da proporção de subconjuntos de leucócitos no rato um modelo de melanoma 6, que também se correlacionou com a diminuição do crescimento do tumor. Assim, as análises detalhadas dos subconjuntos de leucócitos dentro de um tumor é agora mais amplamente reconhecida e cada vez mais importante.
Há muitas maneiras de avaliar o microambiente do tumor para leucócitos de infiltração; por exemplo, grupos de engenharia camundongos transgênicos para expressar diferentes proteínas fluorescentes, a fim de imagem do TME 7, imunohistoquímica clássica e imunofluorescência de secções preservadas 8, incluindo diversas modalidades de imagem, como ressonância magnética, PET, microscopia confocal 11/09 – alguns com a capacidade de monitorar intravitally 10,12. Estes podem ser usados com vários agentes de imagiologia molecular, tais como as nanopartículas 13 ou 14 novos agentes de contraste que marcar células imunitárias. O nosso método é uma abordagem baseada em citometria de fluxo e tem várias vantagens.Em primeiro lugar, todo o microambiente do tumor pode ser amostrado; no momento da análise, a totalidade da periferia do tumor subcutâneo circundante e é ressecada cirurgicamente para processamento. Isso elimina qualquer tendência potencialmente amostragem dentro de um único tumor e dá uma análise mais "global" do tumor como um todo. Em segundo lugar, utilizando citometria de fluxo multicolor para analisar os subconjuntos de leucócitos nos permite avaliar mais especificamente o fenótipo de leucócitos infiltrantes. Dependendo do número de cores utilizadas, subconjuntos muito específicas podem ser identificadas. Isto é importante uma vez que existem vários subconjuntos de leucócitos dentro de um determinado tipo de célula – ou mesmo subtipo de uma classificação geral – que têm funções diferentes que são potencialmente importante na determinação do destino do tumor. Por exemplo, as células dendríticas plasmocitoides (PDC) têm sido implicados na imunidade anti-tumor de 15. No entanto, o subconjunto de CCR9 + de pDCs tem sido mostrado para ser tolerogénico 16, e mudando o balança de um tal subconjunto pode ter um impacto sobre o crescimento do tumor.
O nosso método é adequado para administração subcutânea ou outros tumores que possam ser ressecados em bloco. Na nossa experiência, os tumores foram ressecados uniformemente na altura da eutanásia. No entanto, é concebível, como tem sido feito em alguns estudos, que um tumor subcutâneo pode ser completamente ressecada com fechamento da pele circundante em uma cirurgia de sobrevivência de 17, permitindo assim uma avaliação adicional do animal. A análise é, então, realizada sobre o tumor ressecado. Assim, os resultados representam um único ponto de tempo no desenvolvimento do tumor. Enquanto isso permite uma visão detalhada no microambiente, é também uma imagem estática do que é, sem dúvida, um processo dinâmico. No entanto, os leucócitos isolados (por exemplo através de separação magnética ou de gradiente de densidade) pode, então, ser analisados separadamente a partir do epitélio e estroma tumoral, ou utilizado em outros ensaios funcionais, para definir ainda o seu fenótipo, tal como foi previously descrita 18. Este método, então, seria útil para qualquer investigadores interessados em compreender a composição dos leucócitos dentro do microambiente do tumor num dado ponto de tempo, quer sob a regulação do curso natural da doença, ou após uma perturbação terapêutica específica. Embora não seja feito por nós, variações deste procedimento pode também potencialmente ser utilizada para analisar porções específicas de um tumor em isolamento. Por exemplo, dado o tamanho do tumor, a zona periférica (s) podem ser dissecados para fora do núcleo central, possivelmente necróticas do tumor para dar o pesquisador uma visão mais espacialmente segregado do microambiente do tumor.
No florescente campo da imunologia tumor, não será sem dúvida um número exponencialmente crescente de estudos que avaliam novos agentes imunomoduladores em modelos de tumores de ratinho. Vários estudos têm destacado as diferenças em função leucocitária específica dentro do tumor em relação ao periférico enbiente. Por exemplo, Shafer-Weaver et al., Mostraram, num modelo de rato que as células T específicas do antigénio efectoras CD8 +, enquanto activa na periferia, foram transformados em células supressoras CD8 +, uma vez que de tráfico para o microambiente do tumor 19. Isso foi em parte devido a TGF, mas outros fatores provavelmente estão envolvidos também. Assim, avaliar subconjuntos de leucócitos – números e as proporções, bem como o estado funcional – dentro do próprio tumor vai dar uma representação mais precisa do efeito de uma imunomodulação especial sobre o destino do tumor.
A nossa técnica permite a análise detalhada do tumor e permite ao pesquisador a oportunidade de identificar mais de perto as alterações em populações de leucócitos do que as abordagens anteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Realizando análise detalhada do microambiente do tumor é crítica na determinação dos mecanismos e efeitos de imunomodulação. Com o aumento da presença de immunotherapeutics no reino clínico humano, a compreensão do impacto desses agentes sobre os leucócitos tumor infiltrando está se tornando indispensável na definição de seu mecanismo de ação. Nos seres humanos, há muitas vezes existem dificuldades clínicos e / ou de logística na obtenção e análise de tecidos de tumor para a análise de leucócito…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações R01-CA169354 e R01-047822 dos Institutos Nacionais de Saúde e um Prémio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos (BCE). RKP foi financiado pelo NIH T32 CA009287-30A1, um Investigator Award ASCO Young, California Breast Cancer Research Projeto Fellowship, e um American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant; BAZ foi financiado pelo NIH concessão AI079320. JM foi apoiado por bolsas do NIH T-32 bolsa de formação T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 e American Cancer Society bolsa de pós-doutorado PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
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