在皮下肿瘤模型的评估肿瘤浸润白细胞亚群
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
专门免疫细胞浸润肿瘤微环境调节肿瘤的生长和存活。恶性细胞必须逃避或颠覆抗肿瘤的免疫反应，为了生存和繁荣。肿瘤采取了一些免疫不同的机制“逃逸”，其中包括的致耐受性DC的招募，免疫调节性T细胞（Treg细胞），和髓源抑制细胞（MDSC）抑制细胞毒性抗肿瘤反应的优势。相反地，抗肿瘤效应的免疫细胞可以减缓肿瘤的生长和扩增：免疫刺激性树突细胞，天然杀伤细胞，怀有先天抗肿瘤免疫和细胞毒性T细胞都可以参与肿瘤抑制。亲和抗肿瘤白细胞之间的平衡，最终确定的行为和转化细胞的命运;众多的人体临床研究已经证明了这一点。白细胞亚群内。因此，详细的分析肿瘤微环境已经变得越来越重要。在这里，我们描述了用于分析存在于在小鼠肿瘤模型中的肿瘤微浸润白细胞亚群的方法。小鼠B16黑色素瘤肿瘤细胞皮下接种于C57BL / 6小鼠。在指定的时间，肿瘤和周围皮肤手术切除了整块并加工成单细胞悬浮液，然后将其染色的多色流式细胞术。使用各种白细胞子集标记，我们能够比较浸润控制和凯莫瑞表达肿瘤之间白细胞亚群的相对百分比。研究者可以使用这样的工具来研究免疫存在于肿瘤微环境，当与肿瘤生长的传统的卡钳尺寸测量结合时，将有可能让他们阐明变化对肿瘤生长的影响，在免疫组合物中。这样的技术可以应用于任何肿瘤模型，其中肿瘤及其微环境Ç一个被切除和处理。
Introduction
肿瘤的生长和促进和回归之间的平衡是，部分地依赖于存在于所述微1,2-亲和抗肿瘤浸润白细胞的平衡。为了研究肿瘤微环境（TME），并具体指明浸润白细胞亚群，我们在小鼠肿瘤模型开发用于皮下肿瘤的评估的方法。研究肿瘤微环境的重要性是众所周知的，并且在文献中的支持。大量研究表明，亲和抗肿瘤浸润免疫细胞的平衡可影响肿瘤生长的结果，不仅在小鼠而且人类研究（在3,4综述）。例如，Curiel 等。显示恶化的卵巢癌患者的临床结果均与增加的肿瘤浸润调节性CD4 + T细胞（Treg细胞）5百分比的存在。我们自己的工作也呈无效果对白细胞亚群在小鼠黑素瘤模型6，它也与比VEL白细胞趋化减少肿瘤的生长。因此，在一个肿瘤的白细胞亚群的详细分析，现在更广泛的认可和越来越重要。
有许多种方法来评价肿瘤微环境对白细胞浸润;例如团体已经工程化的转基因小鼠来表达各种荧光蛋白，以图像在TME 7，经典免疫组化和保存部8，包括各种成像模态，例如MRI，PET共聚焦显微镜9-11的免疫荧光-一些与能力监控intravitally 10,12。这些可与各种分子成像剂，如纳米颗粒13或新颖造影剂14，其标记的免疫细胞。我们的方法是一种流式细胞仪为基础的流动的方法和具有若干优点。首先，整个肿瘤微环境进行采样;在分析时，整个皮下肿瘤且环绕周边被手术切除处理。这消除了在一个单一的肿瘤的任何潜在的抽样偏差，并给出一个更“全球性”分析的肿瘤的整体。其次，使用多色流式细胞仪来分析白细胞亚群可以让我们更具体地衡量浸润白细胞的表型。取决于所使用的颜色的数量，很具体的子集可被识别。这是很重要的，因为有在一个特定的细胞类型数白细胞亚群 – 或甚至在一般亚型分类 – 具有不同的功能，即是在确定肿瘤的命运可能显著。例如，浆细胞样树突细胞（PDC）有牵连的抗肿瘤免疫15。然而，中pDCs的CCR9 +子集已被证明是致耐受性16和移位巴喷枪这样的一个子集可以具有对肿瘤生长的影响。
我们的方法是适合于皮下或能被切除整块其他肿瘤。在我们手中，肿瘤均匀地安乐死的时间切除。然而，可以想到，作为已经在一些研究中已经完成，即皮下肿瘤可以完全切除，在一个存活手术17周围皮肤的封闭，从而使动物的其他评估。然后在切除肿瘤进行分析。因此，该结果代表在肿瘤的发展的单个时间点。虽然这允许详细研究进入微环境，它也是什么无疑是一个动态过程，静态图片。然而，分离的白细胞（ 例如，通过磁分离或密度梯度）然后可以从肿瘤上皮细胞和间质单独分析，或在其他，功能测定法中使用，以进一步确定它们的表型，因为一直PREVIously描述18。该方法中，然后，将是有兴趣了解肿瘤微环境内的白细胞的组合物在给定时间点的任何调查是有用的，无论是在自然病程的设置，或之后的特定治疗扰动。虽然不是由我们完成的，该过程的变化可能也可能被用来分析在隔离肿瘤的特定部分。例如，给定的肿瘤的大小，所述周边区（S）可被解剖远离肿瘤的中心，可能坏死核心，得到研究者更空间隔离视图肿瘤微环境的。
在肿瘤免疫的新兴领域，无疑将是一个指数越来越多的研究评估在小鼠肿瘤模型新型免疫调节剂。几份报告都强调肿瘤与周围设有内特定的白细胞功能的差异vironment。例如，谢弗-Weaver 等人。表明在抗原特异性T效应CD8 +细胞，而活跃在外围，被转化到的CD8 + T抑制基因细胞，一旦他们贩卖到肿瘤微环境19的小鼠模型。这是由于TGF-β部分，但其他因素是可能的介入。因此，评估白细胞亚群 – 数字和比率，以及功能状态 – 肿瘤本身内将给出一个特定的免疫调节对肿瘤命运的影响的更准确的表示。
我们的技术允许肿瘤的详细分析，并提供了研究者的机会更密切地确定改变白细胞种群比以前的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在进行肿瘤微环境的详细分析在确定的机制和免疫调节的影响是至关重要的。与免疫治疗的增加存在于人类的临床领域，了解这些药物对肿瘤浸润白细胞的影响变得必要在确定它们的作用机理。在人类中，有经常存在在获得和分析肿瘤组织对白细胞子集分析，并且因此外周免疫应答的分析临床和/或后勤困难常常执行。进行临床前研究的动物模型使研究人员更充分地发掘免疫调节剂，肿瘤本身对免…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了补助R01-CA169354支持 和R01-047822 来自美国国立卫生研究院和退伍军人事务部（ECB）优异奖。 RKP是由NIH T32 CA009287-30A1，一个ASCO青年研究者奖，加州乳腺癌研究项目奖学金，和美国癌症协会的指导式研究学者格兰特的支持; BAZ是由美国国立卫生研究院资助AI079320支持。 JM是由美国国立卫生研究院T-32培训资助T32-AI07290- 25，T32-AI07290-24和美国癌症协会博士后奖学金PF-12-052-01-CSM奖学金支持。
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
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