Summary
שינוי Biolistic הוא שיטה המשמשת ליצירת אינטגרציה יציבה של DNA לתוך הגנום של neoformans הפתוגן קריפטוקוקוס האופורטוניסטי באמצעות רקומבינציה ההומולוגית. נדגים שינוי biolistic של מבנה, שבו יש קינאז אצטט גן המקודד התמזג mCherry תג הניאון לneoformans ג.
Abstract
Basidiomycete neoformans קריפטוקוקוס, הפתוגן האופורטוניסטי פולשנית של מערכת העצבים המרכזית, הוא הסיבה השכיחה ביותר לדלקת קרום המוח פטרייתי בעולם וכתוצאה מכך יותר מ 625,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. למרות electroporation פותח להפיכתו של פלסמידים בקריפטוקוקוס, רק משלוח biolistic מספק אמצעי יעיל כדי להפוך את ה- DNA ליניארי שניתן לשלב לתוך הגנום ידי רקומבינציה ההומולוגית.
אצטט הוכח להיות מוצר תסיסה גדול בזיהום cryptococcal, אבל המשמעות של זה עדיין לא ידוע. מסלול חיידקים המורכב מהאנזימים xylulose-5-פוספט / פרוקטוז-6-פוספט phosphoketolase (XFP) וקינאז אצטט (Ack) הוא אחד משלושה מסלולים אפשריים לייצור אצטט בג neoformans. הנה, אנחנו מדגימים את שינוי biolistic של מבנה,שגן קידוד Ack שהתמזג לתג פלורסנט mCherry, לג neoformans. לאחר מכן, אנו מאשרים שילוב של היתוך ACK -mCherry למוקד ACK.
Protocol
הערה: התכנית הכוללת של פרוטוקול זה מתואר באיור 1.
1. ג neoformans הכנה
- עבור כל תגובת שינוי, לגדול 2-3 O מיליליטר / תרבות N של ג neoformans במדיום YPD ב 30 ° C רועד ב 250 סל"ד.
- צנטריפוגה O / תרבות N במשך 5 דקות ב 900 XG ב 10 ° C וזורקים supernatant.
- Resuspend כל תא גלולה ב 300 μl של דקסטרוז בינוני Peptone השמרים (YPD).
- שימוש בחרוזי זכוכית, בעדינות להפיץ 300 μl של ההשעיה התא שטף על אגר YPD המכיל סורביטול 1 M.
- לאפשר צלחות לייבוש בטמפרטורת הסביבה במשך 3-4 שעות.
2. זהב microcarrier הכנה
- Resuspend 0.25 גרם של 0.6 מיקרומטר חרוזים זהב ב 1 מיליליטר של DDH 2 O, צנטריפוגות 1 דקות ב 900 XG כדי גלולה את החרוזים, ולהסיר את supernatant.
- Resuspend חרוזים הזהב ב 1 מיליליטר של 100% אתנול. </ Li>
- להפיץ את החרוזים ל4 צינורות, 250 μl כל אחד, ולהוסיף 750 μl של 100% אתנול.
- aliquots חרוז זהב החנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. DNA הכנה
- הכן דיסקי biolistic macrocarrier כתומים על ידי השריית אותם במלקחיים באמצעות אתנול 100%. דיסקי מקום לצלחת פטרי גדול המכילה Drierite לייבוש (לוודא Drierite לא נוגע בדיסקים).
- לאחר יבש, לחץ על דיסקי macrocarrier למחזיקי דיסק כסף (ניגבו את העבר עם 100% אתנול).
- חרוזים זהב וורטקס (מוכנים כמו בשלב 2) וμl 12 aliquot לתוך 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge, צינור אחד לכל שינוי.
- הוסף לכל צינור כדי: 2 מיקרוגרם של ה- DNA (רצוי 2 μl של 1 מיקרוגרם / μl של DNA), 10 μl 2.5 M CaCl 2, ובסיס חופשי 2 μl M 1 spermidine.
- הגדרת בקרה שלילית כמו בשלב 3.4 אך ללא DNA.
- מערבולת צינור כל דגירה בטמפרטורת הסביבה ל5 דקות. בעדינות קפיצית כל צינור מדי פעם כדי resuspend חרוזים התיישבו במהלך דגירה זה.
- צינורות ספין ב 225 XG למשך 30 שניות עד גלולה חרוזים הזהב מצופה DNA. מוציא בזהירות את supernatant (על ידי pipetting או שאיפה) וזורקים.
- חרוזים Resuspend לחלוטין ב600 μl של 100% אתנול על ידי pipetting לאט מעלה ומטה.
- ספין צינורות ב 225 XG למשך 30 שניות עד גלולה חרוזים ללא אריזה. מוציא בזהירות וזורקים supernatant.
- Resuspend חרוזים הזהב מצופה DNA ב 8 μl של 100% אתנול על ידי pipetting לאט מעלה ומטה.
- פיפטה חרוזים זהב מצופה DNA על מרכז דיסק biolistic בקוטר 1 סנטימטר ולאפשר לו להתייבש.
הערה: מעגל זהב מיובש גלוי על מרכז דיסק biolistic מצביע על כך שריכוז מספק של חרוזים זהב הוא הווה.
הערה: דיסקי macrocarrier עמוסים חרוזים זהב מצופה DNA מוכן לשימוש עם אקדח הגן עכשיו.
4. Operating Gun ג'ין
- הפעל את משאבת הוואקום.
- הפעל את גז הליום על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון עד שלחץ של כ -2,200 psi הוא הגיע במד הלחץ.
- הפעל את אקדח הגן על ידי מדליק את אדומה בצד השמאל.
- הקפד שהספיקה לוואקום והאוורור מותאמות כך הוואקום יגיע 28 אינץ 'כספית בתוך 15 שניות.
- הקפד המרחק בין דיסק הקרע וmacrocarrier הוא כ 3/8 אינץ '.
- נקה את כל החדר על ידי ניגוב עם אתנול.
- להטביע את דיסקי הקרע באתנול 100%. לאפשר לו להתייבש על משטח סטרילי (למשל, פטרי צלחת).
- השתמש במפתח מומנט כדי לשחרר את בעל דיסק קרע. הכנס דיסק קרע נקי לבעל. לדפוק את בעל דיסק קרע בחזרה למקומו והדק עם מפתח מומנט על ידי הפיכתו פעם לימין.
הערה: תקליטורי קרע יוחלפו הבא כל לירות. - לצלול המסכי רשת דואר באתנול 100%. לאפשר לו להתייבש על משטח סטרילי (למשל, פטרי צלחת).
- לאחר יבש, למקם את מסך רשת שטף על צלחת הרכבת פלסטיק הלבנה. הנח את צד DNA בעל דיסק macrocarrier לתוך תא הדיסק. לדפוק על מכסה הכסף, ומניח את צלחת ההרכבה בחריץ הגבוה ביותר.
הערה: מסך הרשת יוחלף לאחר כל לירות. - מניחים צלחת אגר YPD המכילה 1 M סורביטול על הצלחת התחתונה.
- כבה תא דלת ומנעול למקום.
- לדחוף והחזק את המתג האדום באמצע עד לעסוק ואקום ולאפשר הוואקום כדי להגיע 28 אינץ 'Hg. ברגע שהוא הגיעה לרמה ואקום הנכונה, להעביר בורר זה למצב למטה. כאשר מוכן, החזק את המתג האדום על הזכות לפטר. כאשר דיסק קרע אבא, שחרר מייד את לחצן האש ולחץ על המתג האדום באמצע למצב האמצע לפרוק התא ל0 psi.
- לנקות את דיסק קרע הפסולת ולכבות את אקדח הגן. לאחר מכן לכבות את heliuגז מ 'על ידי סיבוב הכפתור בכיוון השעון, ולבסוף, לכבות את משאבת הוואקום.
5. תאי ציפוי שינו
- אפשר צלחות השינוי לשבת על RT במשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים להתאושש.
- 700 μl פיפטה של YPD לצלחת. השתמש מגרד תא לגרד בעדינות את התאים מהנוזל אגר ופיפטה לתוך צינור microfuge סטרילי 1.5 מיליליטר. חזור על שלב זה כדי להבטיח את כל התאים כבר התאוששו מהצלחת.
- גלולה תאים ב 225 XG למשך 30 שניות. להסיר ולסלק supernatant.
- Resuspend גלולה ב 500 μl של YPD.
- פיפטה של ההשעיה התא 100 μl על המרכז + צלחות האנטיביוטיקה YPD ולהפיץ באמצעות חרוזים זכוכית.
- השאר צלחות הפוכות ב RT במשך 3-4 ימים. כמושבות מופיעות, תיקון על YPD החדש + צלחות אנטיביוטיות.
6. בידוד הדנ"א הגנומי לPCR
הערה: זו גרסה שונה באמצעות מגיבים מערכת טיהור DNA (ראה טבלה של חומרים).
- לגדול תרבות 5 מיליליטר של כל אחד מג transformants neoformans בנוזל YPD ב 30 ° C רועד ב 250 סל"ד O / N.
- גלולה 3 מיליליטר של תאים ב 900 XG, וגלול ב600 μl של פתרון תמוגה גרעינים.
- מוסיף את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש עם 200 μl של חומצת 0.5 מ"מ שטף חרוזי זכוכית.
- Homogenize במשך 45 שניות בbeadbeater מיני בטמפרטורת הסביבה, צינור מגניב על קרח, ולחזור.
- לאפשר מדגם להתיישב על קרח למשך 2 דקות ולהעביר supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. הוסף 200 μl של פתרון ממטרים חלבון לכל צינור, (100 μl לכל 600 μl של supernatant התאושש) ומערבולת במרץ במשך 20 שניות.
- לאפשר דגימות להתיישב על קרח למשך 5 דקות, וצנטריפוגות ב 11,000 XG במשך 3 דקות.
- מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר נקי המכיל 300 μl של isopropanol RT. לערבב בעדינות על ידי היפוך.
- צנטריפוגה דגימות 11,000 XG למשך 2 דקות, להסיר בזהירות את supernatant, ולנקז את הצינורות על מגבות נייר.
- להוסיף 300 μl של RT אתנול 70% לכל צינור, בעדינות להפוך ללשטוף את הכדור.
- צנטריפוגה דגימות 11,000 XG למשך 2 דקות, ובזהירות להסיר את כל אתנול.
- מסננים את הצינור על מגבות נייר נקיות, ולאפשר לגלולה לייבוש באוויר במשך 10-15 דקות.
- הוסף 50 μl של פתרון להחזרת נוזלי DNA ו -1.5 μl של פתרון RNase לכל גלולה ומערבולת.
- צנטריפוגה דגימות במשך 5 שניות כדי להסיר את כל הנוזל מהכובע.
- דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- רעננות DNA על ידי דוגרים הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- לכמת DNA spectrophotometrically על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר (קריאת 260 של 1.0 היא שווה ערך ל~ 50 מיקרוגרם / DNA פעמיים תקועים מיליליטר), ולהשתמש עד 200 ng בכל תגובת PCR.
בידוד RNA 7. להפוך transcriptase-PCR.
- באמצעות ערכת טיהור RNA (ראה טבלה של חומרים), בצע את הוראות היצרן כדי לבודד RNA מתאי שמרים באמצעות minibeadbeater.
- לכמת את הריכוז של RNA על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר (קריאה 260 של 1.0 היא שווה ערך ל~ 40 מיקרוגרם / מיליליטר RNA חד-גדילים).
- שימוש בערכת RT-PCR (ראה טבלה של חומרים), בצע את הוראות היצרן כדי להגדיר את תגובות RT-PCR עם כ 1 מיקרוגרם של RNA. לתוצאות שהתקבלו במחקר זה, השתמש בצבעי היסוד המפורטים בטבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שינוי biolistic מוצלח של ג ניתן להשיג neoformans על ידי ביצוע תכנית זו פרוטוקול (איור 1). עם שינוי biolistic, לירות מוצלחת של חרוזים זהב מצופים מצויינים על ידי טבעת זהב גלויה על הצלחת לאחר DNA היא ירייה (איור 2 א). מושבות אמורות להופיע בתוך 4-5 ימים שבם השאירו בטמפרטורת חדר לאחר ציפוי התאים התאוששו מצלחות סורביטול YPD + 1M על גבי מדיה סלקטיבית. הפיכת 2 מיקרוגרם של ה- DNA צריכה לגרום 20 עד 30 מושבות (איור 2). כאשר מושבות מופיעות, הם צריכים להיות restreaked על תקשורת סלקטיבית למושבות בודדות.
ניתן לגדל המושבות בודדות בתקשורת YPD, ושניהם DNA ו- RNA יכולים להיות מבודדים מהתאים אלה ונותחו באמצעות PCR וRT-PCR כדי לאשר אינטגרציה וביטוי הולמים. אם פרוטוקול זה משמש להיתוך גן מתויג, כמו בדוגמא זו, פריימרים הייתם צריכים tלחשל o בתוך אזור הקידוד של הגן של העניין (פריימר 2) ובתוך אזור noncoding '3 של הגן של עניין (פריימר 4) (איור 3 א). עם מבנה זה, DNA המוגבר מתגובת PCR היה רצף לאישור נוסף שתג mCherry התמזג במסגרת לגן ACK. אישור PCR חיובי יהיה מוצר PCR גדול יותר מה- DNA שבודד את התאים הפכו בהשוואה ל- DNA מבודד מהתאים מהסוג בר. תגובת PCR נוספת תהיה גם צריכה להתנהל תוך ניצול מערך פריימר (פריימרים 2 ו -5) שבו תחל אחד anneals מחוץ למבנה ובתוך הגנום שמסביב (פריימר 5) כדי לאשר את רקומבינציה הנכונה למוקד הרצוי (פריימר 7 בטבלה 1) (איור 3). RT-PCR ישמש לוודא כי הן הגן של עניין והתג שניהם באו לידי הביטוי (איור 3 ג). רצף של ההזמנה אישית מוצר היתוך RT-PCRקייטס שהתג התמזגו כראוי לגן ברמת RNA.
אם פרוטוקול זה משמש כדי לדפוק את גן של עניין, סטי פריימר לPCR צריכים להיות מתוכננים כך שתחל אחד anneals לרצף הגנום מחוץ למבנה שבו צריך לשלב מחדש לתוך הגנום, ותחלו האחרים anneals או באזור הקידוד של הגן או בסמן סלקטיבית. אישור חיובי שיש לבנות recombined בהצלחה ונכונה לגנום יהיה הנוכחות של המוצר בגודל הנכון עבור קבוצת פריימר שanneals בתוך הסמן אבל לא עם קבוצת פריימר שanneals לגן של עניין. סט פריימר אחר צריך להיעשות כי יש פריימר אחד שanneals מחוץ למבנה שנועד, בו נעשה שימוש בPCR כדי לוודא שהאירוע התרחש רקומבינציה במוקד הנכון. באותו העיצוב ליצור נוקאאוט, RNA מבודד משני התאים הפכו וסוג בר תאים (WT), וRT-PCR הוא ביצע כדי לוודא שאין ביטוי של הגן של עניין הוא ציין מהתאים הפכו.
בגלל תג ניאון התמזג לגן ACK, אישור נוסף שרקומבינציה הייתה הצלחה למוקד הרצוי וRNA שהוא מתורגם לחלבון הוא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4). באופן אידיאלי, תנאים כבר הוקמו בו ידוע כי חלבון העניין מתבטא. עם זאת, אם אות הניאון היא נמוכה מדי להתבונן, קיימת אפשרות שרקומבינציה המוצלחת עדיין קרתה, אבל תנאי צמיחה שיהיה צורך לשנות בסיכוי שהתנאים אופטימליים לא היו נפגשו לביטוי מספיק, מה שיוביל לניאון נמוך אות. זה היית צריך להיות מאושר בשיטות אחרות כגון כתם מערבי.
"/>
באיור 1. תכנית הפרוטוקול.
איור 2 א. חרוזים זהב מצופה DNA ירה בהצלחה על צלחת סורביטול YPD + 1M. טלאי כתום ראה במרכז צלחת סורביטול YPD + 1M נובע מחרוזי הזהב מצופה DNA, המצביעים על הכנה נכונה זהב, כמו גם לירות מוצלח . איור 2 ב. הפיכת 2 מיקרוגרם של תוצאות ה- DNA ב20-30 מושבות לכל צלחת. אם התאים דוללו כאמור בפרוטוקול, כ 20-30 מושבות צפויות לפני ציפוי בתקשורת סלקטיבית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 א. סכמטי של ACK: mCherry:.. מבנה ניאו ועיצוב פריימר איור 3 ב PCR משמשים כדי לאשר רקומבינציה ההומולוגית מוצלחת. נתיבי 1 ו -2: מוצרי ה- PCR שהושגו באמצעות פריימרים 2 ו -5 (טבלת 1) עם הדנ"א הגנומי מהסוג בר ג H99 neoformans (מסלול 1) וACK: מתח mCherry הפך, (מסלול 2). גדלים צפויים הם 1,511 ו5622 נ"ב, בהתאמה. מסלולים 3 ו 4 הם מוצרי ה- DNA של ג neoformans H99 (גודל צפוי 1,443 נקודות בסיס) וACK: mCherry (גודל צפוי 5552 נ"ב) זנים, בהתאמה, באמצעות פריימרים 2 ו -4 בטבלה 1. נתיבי 5 ו -6 הם מוצרי DNA של ג H99 neoformans (לא צריך לחשל) וACK: mCherry (גודל 3016 נ"ב צפוי) זנים, בהתאמה, באמצעות פריימרים 1 ו -3 אישור איור 3 ג RT-PCR ביטוי של תג mCherry.. הנתיבים העליונים הם מוצרי cDNA של מוצר ACKmCherry ההיתוך (צפוי גודל 683 נ"ב) המוגבר מג neoformansH99 וACK:. זני mCherry באמצעות פריימרים 2 ו -3 בטבלה 1 הגן אקטין נכללו כביקורת והיה מוגבר באותם תנאים כפי שACKmCherry (גודל צפוי 567 נ"ב) פריימרים באמצעות 6 ו -7 בטבלה 1. אנא לחצו על כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הקרינה של mCherry מתויגת Ack. ניתוח מיקרוסקופי של זני ייצור Ack התמזגו לתג mCherry עם אופטימלי עירור ב 587 ננומטר ואופטימלי פליטה ב610 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| 1 | KI003 | 5 '- TCT GGA AGC CAC GTA GCG AGG - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'- AAC GCT TTG GCC GGT ACT ACC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'- TAG GAC AGC TTC AAG TCG GGG -3 " |
| 4 | KI004 | 5 '- AAG AGG AAT TC GAC TTG GGG - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | אקטין 1 | 5'- CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 " |
| 7 | אקטין 2 | 5'- CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 " |
פריימרים הטבלה 1. PCR וRT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (פרס # 0,920,274) וניסוי הדרום קרוליינה תחנת פרויקט SC-1,700,340. נייר תרומת מס 'זה isTechnical 6283 של תחנת ניסיונות אוניברסיטת קלמסון. המחברים מודים לד"ר לוקאש Kozubowski לעצות מועילות שלו בפיתוח של פרוטוקול זה סופי ושריל ד"ר אינגרם-סמית, קייטי גלן, וגרייס Kisirkoi לקריאה הביקורתית שלהם של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
