Abstract
Употребление алкоголя расстройства (AUD) является серьезной проблемой здравоохранения. Несмотря на большое наследственный компонент к AUD, несколько генов были однозначно вовлечены в их этиологии. Плодовая муха, дрозофилы, является мощная модель для изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе поведения, связанных с алкоголем, и поэтому имеет большие перспективы для выявления и понимания функции генов, которые влияют на AUD. Использование модели Drosophila для этих типов исследований зависит от наличия анализов, которые надежно измерить поведенческих ответов на этанол. Этот отчет описывает анализ подходящий для оценки чувствительности этанола и быстрый допуск в мух. Чувствительность Этанол измеряется в данном исследовании зависит от объема и концентрации этанола, используемого, разнообразие сообщалось ранее генетических манипуляций, а также время, в течение мухи размещены без пищи непосредственно перед тестированием. В отличие от этого, этанола сensitivity измеряется в этом анализе не зависит от энергичности обработки зольной, пола мух и добавок в ростовой среде с антибиотиками или живых дрожжей. Три различные методы количественного чувствительности этанола описаны, все это ведет к существенно неразличимые результаты чувствительности этанола. Масштабируемая природа этого анализа, в сочетании с его общей простоты в настройке и относительно низкий расход, сделать его пригодным для малых и крупных генетического анализа чувствительности этанола и быстрого толерантности у дрозофилы.
Introduction
Употребление алкоголя расстройства (AUD) является огромной проблемой здравоохранения во всем мире (обзор в 1). Хотя механизмы приводные развитие AUD сложны, эти расстройства имеют большое генетический компонент (например, 2). Большой наследуемость AUD и консервативных поведенческих реакций на этанол во многих видов (рассмотренных в 3,4), породили сильный интерес к использованию генетических модельных организмов проверки причастности конкретных генов в этаноле, связанных с поведением по отношению к лучшему пониманию молекулярных основ AUD. Плодовая муха, дрозофилы, стала ведущей моделью организма для изучения молекулярно-генетических механизмов этанола, связанных с поведением (обзор в 3,4). Исследования, проведенные в мух подчеркнули роль для нескольких сигнальных путей в поведенческих ответов на этаноле (обзор в 5). Интересно, что некоторые из генов и путей, которые влияют на поведенческие RESPONSES в этаноле в мух также вовлечены в грызунов этанола, связанных с поведением и / или человеческого AUD (например, 6-14). Сохранение механизмов вождения этанола, связанных с поведением разных видов, в сочетании с набором генетических инструментов, доступных в модельной системе Drosophila, подчеркивают полезность лету модели с фруктами для исследования генетики поведенческих реакций в этанол.
Чувствительность 15,16 и толерантность (обзор в 17) к этанолу в организме человека связана с развитием AUD. Оба этих поведенческих реакций в этаноле могут быть смоделированы в мух с помощью различных лабораторных анализов (обзор в 3,4). Все лету анализов, известных авторов основаны либо на зависимости от времени этанола, вызванных седации / несогласованность или зависящих от времени восстановления из этанола седации.
В предыдущей статье из нашей группы по генетике чувствительности этанола и гДопуск APID у дрозофилы, был использован поведенческий тест на основе паров этанола, вызванных седации мух 18. Испытание в этом тесте была инициирована передачей живой взрослых мух без анестезии, чтобы очистить пищевых флаконы, захвата мух в пузырьках с ацетата целлюлозы пробки, добавлением этанола к началу (т.е. не муха сторона) ацетата целлюлозы вилки и уплотнения флакона мух, ацетата целлюлозы вилку и этанола с силиконовой пробкой (см схематический рисунок S3, ссылка 18). Несколько флаконов, представляющих различные группы мух оценивали параллельно, увеличивая пропускную способность этого анализа. Флаконы были даны анонимный код и экспериментаторы не знали о группе лечения, чтобы предотвратить непреднамеренное смещение в оценке седативного эффекта. В стандартном эксперименте, летит в флаконах прослушивались мягко 6-минутными интервалами, и после восстановления 30 сек, количество седативных мух в каждом флаконе подсчитывали и Converted к процентному активных мух. Мухи поглощается парами этанола из ацетата целлюлозы вилкой в зависимости от времени образом, в результате чего прогрессивное увеличение внутреннего этанола 18 и седации (CF задание 18 и Рисунок 1A и 1B в настоящем докладе). Торможение в данном анализе была функционально определяется как мух (I) положении при отсутствии ходьба или (II), лежа на спине с или без хлопая крыльями. Вот это этанол седативный анализ описан в деталях, в дальнейшем Оперативная Оптимизация отношение к его использованию обеспечивается, и анализ используют для решения вклад опций пищевых добавок на чувствительность муха седации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. День перед анализом
- Сбор мух в свежих флаконах продовольствие групп 11 (разового секса) под неглубоким (1-5 мин) CO 2.
- Разрешить мух для восстановления O / N в пищевых флаконах экологически контролируемом помещении (обычно 25 ° C, 60% относительной влажности, 12 ч цикл свет / темнота).
- Подготовка этанольного раствора (ов) путем разбавления чистого (100%) этилового спирта в очищенной (≥18 МОм) воды до конечной концентрации (ы), подходящей для запланированного эксперимента. Разрешить решение (ы), чтобы вернуться к РТ O / N.
Примечание: Разбавление этанола является экзотермической.
2. День Пробирной
- Для каждого флакона мух должны быть протестированы, подготовить (I) чистый, пустой флакон пищевых продуктов; т.е., тестирование флакон, (II), ацетат целлюлозы новый штекер, (III) силиконовые пробкой и (IV) 1 мл раствора этанола (таблица 3).
- Подготовка комнату тестирования, регулируя температуру до 20-25 ° С и относительной влажности воздуха до 55-65%.
- Есть еще один работникназначить уникальный код для каждой группы флаконов и записать код для последующего использования. Поместите закодированные флаконы с мухами в комнату тестирования акклиматизироваться в течение нескольких минут.
- Этикетка пустые флаконы тестирования, чтобы соответствовать коды на лету флаконах из 2,3.
- Построить жесткий журнал тестирования копия, введя коды в столбцах (один столбец / флакон) в таблице, аналогичной таблице 1.
- Использование журнал тестирования в качестве руководства, организовать закодированные флаконов пищу с мухами и пустых флаконов тестирования в соответствие массивов в комнату тестирования.
Примечание: разумный максимум количество флаконов для проверки 24 (то есть, 6 комплектов 4 флаконов в каждой). - Передача летит из пищевых флаконах в согласованных / меченых пустой тестирования флаконов и сразу вставить ацетата целлюлозы пробки в испытательных флаконах до ацетата целлюлозы розетки не 2 см ниже флаконе вершины.
- Далее, обрабатывать каждую строку из четырех флаконах в виде набора в шахматном минутные интервалы 1.
- Для оценки времени 0, понять каждого флакона индивидуально WIth большим и указательным пальцами, слегка постучите по на столе три раза постучать мух на дне флакона, подождать 30 сек, а затем подсчитать количество мух, которые являются неподвижными / мертв. Запишите число неподвижных / мертвых мух для каждого флакона во время 0 мин в печатном журнале тестирования.
- Запуск таймера подсчета до непрерывно в момент времени 0 и сразу же начинают добавлением 1 мл этанола, ацетата целлюлозы пробок в флаконы для первой строки набора / 4 ампулы. Добавить 1 мл этанола, ацетат целлюлозы пробок в флаконы по 5 сек интервалом в порядке они будут испытаны. Добавить этанола с пробками из ацетата целлюлозы в круговом движении, так что этанол поглощается равномерно по всей ацетата целлюлозы пробок. При этанола был добавлен ко всем 4 испытательных пробирок в наборе, вставить пробку силикона в каждую пробирку, чтобы запечатать его.
- Иногда 1, 2, 3, 4 и 5 мин, добавить 1 мл этанола, второй, третий, четвертый, пятый и шестой наборы 4 ампулы, соответственно. Продолжайте установку силиконовые пробки последобавления этанола с каждым набором 4 ампулы.
- В момент времени 6 мин, проверить первый набор 4 флаконы, держа каждый флакон с большим и указательным пальцами, нажав аккуратно на стол три раза, чтобы сбить мух в нижней части флакона, ожидая 30 сек, а затем подсчета и записи общее количество мухи, которые седация. Оценка летает как успокоительное, если они (я) стоять на полу флакона, но не ходить или (II) лежат на своих спинах с или без хлопая крыльями.
- Ручка каждый флакон в наборе в 5-секундными интервалами, используя график в таблице 2.
- Порой 7, 8, 9, 10 и 11 мин проверьте второй, третий, четвертый, пятый и шестой наборы флаконов, соответственно, как это сделано в первом сете.
- Во время 12 мин, проверить первый набор 4 флаконов снова, как описано в 2,12 и продолжить тестирование во второй, третий, четвертый, пятый и шестой наборы флаконах по 13, 14, 15, 16 и 17 мин, соответственно.
- Продолжить тестирование мух, как описано в 2,12, пока все мухи не сedated.
- Введите общее количество мух в каждом флаконе в жесткого журнале тестирования копирования. Цензор неподвижные / мертвых мух в момент времени 0 из общего количества мух.
- Рассчитать процент активных летит на каждой оценки временной точке и данные графика в виде% активных мух (Y-ось) в зависимости от времени (ось х). Количественного этанола седативный эффект путем интерполяции седации часам 50 значений (ST50, время до 50% седации) с третьего порядка полинома или сигмовидной кривой соответствует или вычисления площади под кривой.
- Компиляция данных из расшифрованных флаконах и выполнять статистический анализ (например, в одну сторону ANOVA с Bonferroni теста множественного сравнения) по мере необходимости для экспериментального дизайна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Необработанные данные из этого анализа этанола седации являются количество мух, которые седатированы в зависимости от времени экспозиции паров этанола. Необработанные данные преобразуются в процент активных мух, как функции времени (первичных данных, 1А, В, D - F). Чувствительность к этанолу седативного из первичных данных может быть количественно, как Торможение времени 50 (ST50), время, необходимое для 50% от мух, чтобы стать седативные или AEA под кривой (AUC), с помощью интерполяции кривой подходит. Ранее сообщалось, 18 полиномиальные кривые третьего порядка соответствовать первичные данные, как ожидалось (в среднем R 2 = 0,934, N = 24, рис 1а), хотя сигмоидальных кривые соответствуют первичные данные несколько лучше (средний R 2 = 0,997, N = 24; Фиг.1В). В качестве альтернативы определения значений ST50 от кривой припадков, чувствительность этанола седативный из первичных данных также может быть количественно как площадьпод кривой (AUC,% активных мухи х раз) (рис 1С). Результаты этих трех методов количественного очень хорошо коррелируют друг с другом (Pearson R 2 ≥0.998, п = 24) и, по существу, неразличимы (рис 1С), хотя блоки обязательно различны для ST50 (мин) и AUC (% активного летит х раз). Детали, касающиеся всех расчетов, электронные таблицы, используемые и т.д. доступны из соответствующего автора. Следует отметить, что более высокие и более низкие значения ST50 (или AUC) указывают притуплены и повышена чувствительность к этанолу седативный эффект, соответственно. Для согласованности с предыдущим докладом 18, значения ST50, полученные из полином третьего порядка кривая совпадет были использованы на протяжении оставшейся части этого study.Importantly, анализ обнаруживает влияние РНК-интерференции против Cnx14D (рис 1D) и мутаций в SCB (рис 1E) , ару и hppy (рис 1F),
Во повседневного использования в данном анализе, нажав флаконов с пробками из ацетата целлюлозы, смоченных 2 мл этанола вызвали пробки из ацетата целлюлозы путешествовать в сторону днища некоторых флаконах в течение нескольких отдельных экспериментов (не показано), тем самым потенциально изменение свободной мухи " пространство и концентрации паров этанола. Кроме того, приблизительно 0,25 мл этанола достигли дна (т.е. сторону весь) из ацетата целлюлозы зажигания, когда они были смочены 2 мл этанола (фиг.2А), возникает возможность, что летит в этих анализов были подвергнуты этанола жидкость в дополнение для паров этанола. Уменьшение объема этанола в ацетат целлюлозы вилки от 2 мл до 1 мл ликвидируется вниз миграция cellulosЕ ацетат вилки во время теста, даже после того, как энергичное постукивание (не показаны), а также устранены измеримых количеств раствора этанола на дне ацетата целлюлозы зажигания (2А). Торможение мух была чувствительна к объему этанола, используемого даже при объемах меньше, чем 1 мл (фиг.1А - C). Используя 1 мл этанола, следовательно, помогает поддерживать постоянную открытое пространство для мух во время теста и гарантирует, что жидкость, этанол не попадает. Мухи, следовательно, по-видимому воздействию этанола исключительно в виде паров в данном анализе. Один мл 85% -ного этанола (т.е. пар из 1 мл 85% (об / об) этанола) и 1-5 день старого W [A] мух были использованы во всех последующих исследований, указанные здесь, если не указано иное.
В экспериментах с 24 флаконов, мухи постучал мягко 6-минутными интервалами, чтобы экспериментатор, чтобы оценить (т.е. цикл через) все флаконы по разумной, установленном schedulе. ST50s из исследований с использованием контрольных мух меньше флаконов и 5-минутными интервалами были сравнимы с ST50s из исследований с 6-минутными интервалами (данные не показаны). Мухи оцениваются на седативный 30 сек после нажатия, чтобы время экспериментатору нажмите набор из четырех пробирок в последовательности до определения статуса Торможение мух в каждом флаконе. Чтобы определить, если различия в освоении силы или время восстановления после нажатия влияние этанола чувствительность седативный эффект, значения ST50 в мужских и женских мух контроля были измерены в то же время постучал в обычном режиме (Обычный) или очень резко (жесткий) и после стандартного 30 сек или более 60 сек восстановление. Нажатие сила (фиг.2В) и время восстановления (фиг.2С) не оказывал измеримого эффекта на ST50 значений в контрольных самцов или самок.
Антибиотики могут быть использованы для подавления роста бактерий в пищевой муха среды. Чтобы определить, если добавки пищевой среде с антибиотиками влияет этанола чувствительность седации,ST50 значения были измерены в мух, выращенных в течение одного поколения, в присутствии или в отсутствие трех антибиотиков (ампициллин, 100 мкг / мл; тетрациклин, 20 мкг / мл; хлорамфеникол, 125 мкг / мл). Разведение летит на этих трех антибиотиков не имело никакого эффекта на чувствительность этанол седации (рис 2D).
Мухи переносят в пустых пищевых флаконах-и, следовательно, лишали пищи и воды в течение ~ 5 мин, непосредственно перед их воздействию паров этанола в седации анализа. Чтобы определить, если количество временных мух хранятся в пустых флаконов пищевых перед началом чувствительность седации воздействие анализов этанол, мухи голодали в течение 6 ч (по крайней мере, 70-кратным по нормали), а затем значения ST50 были измерены. Голодание в течение 6 ч значительно снизился ST50s в обоих мужчин и женщин мух управления (рис 2E). Хотя эффект от голода на ST50 было относительно небольшим (9-14% в этих экспериментах), количество времени, летит SPEй в пустых флаконов до подвергаясь паров этанола в анализе должны быть проведены форму между группами в эксперименте, а также между экспериментами.
Лаборатория муха пища может быть дополнен живых дрожжей (например, 18,20,23,24), чтобы стимулировать производство потомства. Например, пищевые флаконы с добавлением живых дрожжей (Saccharomyces CEREVISIAE) получают взрослые раньше, чем с убитых нагреванием дрожжей или не живых дрожжей (сравните d10-d11, белые полосы, фиг.3А), хотя общее количество потомства получают более 20 дней был неотличим во флаконах с добавлением живой и убитых нагреванием дрожжей (рис 3А). Для решения возможность того, что живых дрожжей производят значимые количества этанола на лету пищи, были измерены эффекты живых дрожжей на (я) этанола в пищевой среде, (II) этанола в мух, и (III) Чувствительность этанол седативный эффект у мух. Еда среде с добавлением живых дрожжей, содержащихся субСущественную количество этанола по сравнению с пищей с добавлением убитых нагреванием или не дрожжей (рис 3б). Тем не менее, контроль мухи выросли на среде с добавлением живых, убитых или нет дрожжей не было неразличимо низкие концентрации внутренней этанола (рис 3C). Кроме того, этанол чувствительность седативный эффект был неотличим в контрольных мух, выращенных на среде с добавлением убитых нагреванием или живых дрожжей (рис 3D).
Рисунок 1. возможности анализа данных (AC) Торможение анализа. Контроль W [] женщины (W 1118 изогенны Блумингтон Индиана Drosophila со Центр Stock # 5905) были выставлены в пар из указанных объемов 85% (об / об) этанола. Данных () Торможение времени курс сочетается с третьего Заказать многочленов. (B)Данные Торможение времени курс сочетается с сигмоидальных кривых. (C) этанол седативный чувствительность количественно как (слева Y-оси) значения ST50 интерполяции полиномами третьего порядка и сигмоидальных кривых или (справа Y-ось) площади под кривой (AUC,% активные мухи х раз). Объем Этанол, но не метод анализа, влияние чувствительности этанол (двусторонняя ANOVA; эффект объема, р <0,0001; эффект метода анализа, нс, N = 8 / группа; данные AUC трансформированные 1/100 для учета разницы в Величина значений). (DF) Представитель времени курс данные. (D) Выражение Cnx14D РНК-интерференции в нервной системе (Elav-Gal4 / v5597) притупляются этанола чувствительности по отношению к контрольной группе (v5597 / + и Elav-Gal4 / + ). (E и F) Мутация ов CB (SCB vol2) и Ару (Ару 8,128) повышенная чувствительность седативный эффект этанола и мутация hppy (hppyKG5537) притупляются этанола чувствительность седации по сравнению с контрольной группой. Данные в EF ранее сообщалось, как ST50 значения 18.
Рисунок 2. Оценка эксплуатационных параметров в седации анализа. (А) количество этанола в нижних 2 мм из ацетата целлюлозы пробок. Объем этанола добавляли к вершинам ацетата целлюлозы зажигания оказывает существенное воздействие на объем этанола, что перемещены в нижнюю 2 мм из ацетата целлюлозы зажигания во время макет 60 мин эксперимента (односторонним ANOVA, р <0,0001; * Bonferroni тест множественного сравнения, 2 мл против 0 и 1 мл, р <0,05 N = 4). Этанол не количественно, как изменение массы ацетата целлюлозы зажигания. (B) Ни бодрости нажав флаконов во время тестирования (Regular, Hard), ни секс мух испытания пострадавших ST50s (два-Wай ANOVA; Эффект разговоров, нс; Эффект от пола, нс; N = 12) (C) Ни время восстановления после нажатия ни секс, оказывают существенное воздействие на ST50s (двусторонняя ANOVA;. влияние времени восстановления, нс; эффект пола, нс;. N = 6) (D) Включение антибиотиков (УВД; ампициллин, тетрациклин и хлорамфеникол) в питательной среде не было общее воздействие на ST50s, но не было эффекта от пола на ST50 (двухсторонней ANOVA; эффект УВД, нс; эффект от пола, р = 0,001; взаимодействие , нс;. N = 6) (E) Влияние голода на чувствительность этанол седации. ST50s были значительно ниже у мух, лишенных пищи и воды в течение 6 часов (Мореной) по сравнению с обычно подается (ФРС) летит; ST50s у мужчин и женщин были неотличимы в целом (двусторонняя ANOVA; эффект от голода, р <0,0001; эффект от пола, нс, N = 12; * Bonferroni несколько сравнительные тесты, эффект от голода у мужчин и женщин, P <0,05) ,
Рисунок 3. Влияние живых дрожжей на рост, содержания этанола и чувствительности седации. () Взрослый потомство от флаконах, содержащих пищевую среду, дополненную не дрожжей (Нет Y), тепло убили дрожжи (убит Y) или живых дрожжей (Live Y). Белые полосы, взрослые потомство возникшими в течение дня 10-11; серые полосы, дни 12-20. В целом, лечение дрожжевой оказали значительное влияние на производство потомства (в одну сторону ANOVAs, все (10-20) дней, р <0,0001; дней 10-11, р <0,0001; дней 12-20, р = 0,0002, N = 5 ). Общее количество потомства, полученного во время всех (10-20) дней было больше из флаконов с убитыми Y и жить Y, чем нет Y (Бонферрони тест множественного сравнения, р <0,05). Во время дней 10-11, флаконы с живой Y произвел больше потомства, чем убитые Y и флаконы с убитыми Y произвел больше потомства, чем нет Y (белые полосы, Бонферрони несколько тестов сравнения, р <0,05). Во время дней 12-20, флаконы Wiго Убит Y произвел больше потомства, чем флаконы с не Y или концертного Y (серые столбики, Бонферрони тест множественного сравнения, р <0,05). (B) Этанол в пищевой среде была значительно выше, во флаконах с добавлением живого Y по сравнению с флаконы с не Y и убиты Y (в одну сторону ANOVA, р <0,0001, N = 5; Бонферрони тест множественного сравнения, р <0,05) (C) Внутренняя этанола в W [] женского мух существенно не влияет добавок с дрожжами (один. -позиционной ANOVA, нс, N = 5-10). Содержание этанола в В и С определяли, как описано 18 (D) значения ST50 существенно не влияет на дополнения питательной среды с дрожжами в мужской или женской W [A] (двухсторонней ANOVA;. Эффектом дрожжей, нс; эффект от пола, нс, N = 12).
| флакон → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Код → | ||||||||
| Общее → | ||||||||
| 0 мин | ||||||||
| 6 мин | ||||||||
| 12 мин | ||||||||
| 18 мин | ||||||||
| 24 мин | ||||||||
| 30 мин | ||||||||
| 36 мин | ||||||||
| 42 мин | ||||||||
| 48 мин | ||||||||
| 54 мин | ||||||||
| 60 мин |
Таблица 1: Типичная журнала тестирования. См протокола шаг 2,5.
| Флакон | Кран | Оценивать |
| 1 | 6 мин 0 сек | 6 мин 30 сек |
| 2 | 6 мин 5 сек | 6 мин 35 сек |
| 3 | 6 мин 10 сек | 6 мин 40 сек |
| 4 | 6 мин 15 сек | 6 мин 45 сек |
Таблица 2:. Типичный стук и график тестирования См протокола шаг 2,13.
| Название материала / Оборудование | Компания | Номер по каталогу | Комментарии / Описание |
| пищевые флаконы | VWR | 89092-772 | узкий |
| Flugs | Genesee / flystuff.com | 49-102 | узкий |
| силиконовый стопор | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| этанол | Фармако-Aaper | 111000200 | 200 доказательство |
Таблица 3: Материалы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Прямые анализы, что воспроизводимо количественно значимых фенотипов имеют большое значение для анализа поведения. Работа, описанная здесь рассматривается ряд практических аспектов в анализе для измерения чувствительности этанол седации и быстрый допуск у дрозофилы. Хотя это и не цель этой работы, поведенческие анализы способствует поддержанию окружающей среды и генетический фон константу для испытуемых в исследовании. Кроме того, сравнение, как правило, следует проводить различие между группами мух, выращенных и проверенных бок-о-бок. Для этого, все летит в рамках отдельных экспериментов в этой работе был тот же самый генетический фон и воспитывались бок о бок в одинаковых условиях окружающей среды (25 ° C, относительной влажности 60%, 12 ч света / темноты) со стандартным пищевой среды (10 % сахарозы, 3,3% кукурузная мука, 2% дрожжей и 1% агар) для тех экспериментов, в которых пища среду явно манипулируют исключением.
ETHAnol седативный анализа, описанного здесь требуется очень мало материалов (пластиковые флаконы, ацетат целлюлозы пробки, силиконовые Пробки и этанол), все из которых являются недорогими и легко доступны из коммерческих источников (таблица 3). Это этанол седативный анализ похож на и в значительной степени основывается на ранее известными способами (например, 6,20,25-27, всесторонне рассмотренных в 3,28). Хотя все эти анализы имеют полезность для измерения чувствительности этанола седации, преимущества анализа описано здесь, включают (I) мухи не подвергаются жидкого этанола при анализе, (II) снижается вероятность того, что мухи может запутаться в хлопка или другого материала, в испытательной флаконе при анализе, (III) возможность протестировать многие группы мух параллельно, и (IV) три варианта объективной количественной оценки чувствительности этанола из первичных наборов данных. Вместе, эти преимущества в значительной степени устранить возможность того, что летит пить этанол, тхат этанола может смачивать наружных поверхностей мух, таким образом, препятствует их общие способности опорно-двигательного аппарата, а также, что производительность мух в анализе могут быть смешивать с трудностями, связанными с запутывание материала в среде тестирования. Кроме того, эти преимущества увеличить общую пропускную способность и воспроизводимость анализа. Кроме того, чувствительность этанола измеряли в данном анализе не зависит от экспрессии эндогенного белый или трансгенный маркера мини-белого 18, что делает его пригодным для исследований с трансгенов и генетических фонов, обычно используемых в Drosophila генетических анализов.
Несколько ключевых параметров следует контролировать, чтобы получить достоверные результаты анализов этанол седации. В дополнение к управлению окружающей среды роста и генетический фон штаммов, что испытуемое (смотри выше), объем и концентрация этанола, конечно, крайне важно, чтобы количественного определения этанола sensitiviТай. Следует отметить, что разбавление этанола в воде является экзотермической. Следовательно, разбавленные этанол решения должны быть разрешены для уравновешивания до комнатной температуры до начала седации анализов. Дополнительный параметр, который должен быть равномерным по всей группы тестируемых продолжительность времени, что мухи размещены в пустых флаконов пищевых перед началом седативного анализа. Два дополнительных параметров также следует контролировать. Количество мух на флакон в идеале должен быть (а) одинакова во всех флаконах и групп, (б)
Количество, которое может быть легко подсчитаны быстро, и (с) количество достаточно велико, чтобы обеспечить относительно гладкой временных курсов седативного эффекта. Одиннадцать летит / флакон хорошо работает в нашей лаборатории и предложил отправной точкой. Последний параметр, чтобы рассмотреть возраст мух, используемых в седации анализов. Хотя нет воспроизводимые эффекты возраста на чувствительность этанола седации в 1-10-дневных мух не было обнаружено (данные не показаны), использование молодых соответствующего возраста животных, кажетсяоправдано с учетом большого литературу по возрастным поведенческих изменений у мух 29,30.
Другие параметры, кажется, не так критично в седации анализов, по крайней мере, когда контрольное тестирование мух, используя диапазоны параметров, описанных здесь. Секс сила нажатия, время восстановления от разговоров, и дополнение лету пищи с антибиотиками (ампициллин, тетрациклин и хлорамфеникол) или живых дрожжей не изменяют чувствительность этанола измеряли, как описано здесь. Кроме того, количественное чувствительность этанола путем интерполяции полином третьего порядка кривых, интерполяции сигмоидальных кривых, или определения AUC от времени данных, конечно, основной седации приводит к существенно неотличимые интерпретации. Хотя никакого эффекта от пола не последовательно наблюдается в исследованиях, описанных здесь, эффекты секса на чувствительность этанола в нескольких дрозофилы генетических фонов были зарегистрированы 31. Таким образом, вполне возможно, что половые эффектыпросто маскируется генетических изменений в W [] фона, используемого здесь. С другой стороны, вполне возможно, что измерительные половые воздействие на поведенческие реакции у дрозофилы требуют еще неизвестные анализа или условий роста. В любом случае, рекомендация, чтобы все параметры как можно более равномерным в седации анализов, в том числе от пола ни одной из групп будучи явно сравнивать.
Учитывая, что живых дрожжей производят значительные количества этанола в лету пищи, это было несколько удивительно, что добавки пищи с живых дрожжей не увеличить внутренний этанол в мух. Одним из возможных объяснений является то, что этанол не образуется равномерно по всей поверхности продукта, и летит не может, следовательно, селективно поглощать пищу без какой-либо относительно низких концентрациях этанола. Дополнительные исследования будут необходимы для решения этой и других возможных объяснений этого факта.
Большое количество модификаций для анализа describред здесь возможны в зависимости от целей эксперимента выполняется. Например, количество флаконов проходят в эксперименте, число мух, испытанных в каждом флаконе, концентрация и объем этанола используется, продолжительность воздействия этанола, интервал времени между оценками седативный эффект, возраста и пола мух проходят , и критерии для седации могут быть изменены, чтобы удовлетворить потребности отдельного лаборатории. Рекомендуется начинать с одной или двумя группами по четыре ампулы при первоначальном изучении анализа, а затем масштабировать до использования количество флаконов, которая обеспечивает пропускную способность, необходимую для реализации проекта. Если неожиданно короткие или длинные ST50s наблюдается, было бы хорошей практикой для обеспечения того, тест мухи были подвергнуты короткий (1-5 мин) раз анестезия, было разрешено, чтобы оправиться от наркоза O / N, были меньше, чем 10 дней, были физически не повреждена в процессе хранения, не смачивается раствора этанола, и не имеют опорно-двигательного аппарата нарушения.
Анализе измеряют этанола чувствительности седативный только и поэтому не предназначены или подходят для оценки других поведенческих реакций с этанолом. Как и все известно этанола поведенческих парадигм в мух, этот анализ требуется мух, в значительной степени нормальные способности опорно-двигательного аппарата и, следовательно, генотипы с нарушениями двигательной не должны быть проверены. Другим ограничением анализа является то, что концентрация паров этанола в пробирке предположительно непрерывно повышается, как улетучивается лекарственного средства из ацетата целлюлозы пробки. Хотя внутренний этанол летает »поднимается постепенно с течением времени во всех летать этанола поведенческие анализов, представляется возможным, что доставка фиксированной концентрации паров этанола в мух может улучшить согласованность результатов этого анализа. Способ доставки фиксированной концентрации паров этанола до сих пор не определены, что позволило бы анализа, которые будут использоваться на шкале, описанной здесь.
Этанол седативныйАнализ, описанный здесь хорошо подходит для генетического анализа чувствительности этанола и быстрого толерантности 18. Среда Рост, генетический фон, концентрация и объем этанола, количество времени, мух проводят в пустых флаконов пищи, и количество и возраст мух, используемых все должны быть под контролем. Предполагая, что эти параметры контролируется должным образом, седативный анализ должен быть пригоден для обоих назад и вперед генетические подходы, которые исследуют молекулярную основу поведенческие реакции на этанол в дрозофилы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A.
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L.
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
