Isolatie en cryopreservatie van de neonatale rat Cardiomyocytes
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
Celcultuur van hartspiercellen is een instrument van cruciaal belang in de moderne cardiale onderzoek. Neonatale rat cardiomyocyten (NRCMs) worden vaak gebruikt omdat de isolatie en cultuur is makkelijker dan die van volwassen ratten hartspiercellen 1. De NRCM methode heeft nog steeds een aantal beperkingen waaronder een lange isolatie procedure en beperkte celproliferatie in de schotel. Er zijn een aantal protocollen voor het isoleren van NRCMs meeste algemeen vereisen 4-48 uur werk 2-6. Bovendien worden de cellen vaak geïsoleerde 1-2 dagen oude rat pups 2,4-7; de timing van de geboorte kan onvoorspelbaar en conflicten met ander werk in het lab zijn. De isolatie kan inefficiënt en verkwistend zijn als alleen een kleine hoeveelheid cellen nodig voor experimenten. De meeste inspanningen op het verbeteren van de workflow focus op de ontsluiting tijd, maar dit is niet de problemen van de timing van de geboorte van de pups op te lossen.
Als alternatief heeft vele laboratoria gebruikencardiomyocyten afgeleid van embryonale stamcellen (SER) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Echter, de herprogrammering en / of differentiatie proces zeer tijdrovend en kostbaar ook. Er kunnen andere problemen bij het gebruik van deze cellen in vitro modellen myocyten. Zowel ESC- en iPSC- afgeleide cardiomyocyten bleken verschillen in elektrofysiologie van primaire cardiomyocyten 8-10 vertonen.
Gedissocieerde NRCMs zijn kunnen worden opgeslagen voor enkele dagen met behulp van koeling 11, toch is dit niet toestaat voor lange termijn opslag. Vloeibare stikstof wordt meestal gebruikt om cellen te behouden voor een grotere tijdsperiode, maar vereist een koude beschermend middel zoals dimethylsulfoxide (DMSO). Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de ideale concentratie van 5-10% DMSO in de bevriezing media zorgt voor cryopreservatie van NRCMs, maar zelfs dan is de levensvatbaarheid blijft laag 12. Hoewel DMSO helpt bij de bescherming van de cellen tijdens de vrijezing kan toxisch zijn voor cellen in concentraties boven 1,5% 13. Eerdere studies hebben aangetoond dat langzaam verwijderen van DMSO uit de cellen, cel levensvatbaarheid kunnen 14 verbeteren.
We zochten de efficiëntie van NRCM celgebaseerde proeven door cryopreserveren de cellen na isolatie te verbeteren. Hierdoor kunnen de cellen worden ontdooid en gebruikt wanneer nodig, waardoor de frequentie van isolatie en het gebruik van dieren. Met deze methode wordt aangetoond dat het mogelijk is NRCMs cryopreserve en ontdooien deze voor gebruik op een later tijdstip. Na het ontdooien van de cellen te behouden een aanvaardbare levensvatbaarheid en produceren NRCM culturen die positief zijn voor α-sarcomerische actinine (α-SA) en contract spontaan zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol maakt het NRCMs worden geïsoleerd, gecryopreserveerd en ontdooid. Het ontdooien van de cellen is een cruciaal deel van de procedure. Een reeks verdunningen DMSO wordt gebruikt om langzaam verwijderen DMSO uit de cellen 14. Het is belangrijk dat de winning van DMSO snel mogelijk nadat de cellen zijn bijzonder gevoelig voor onmiddellijk sterven na ontdooien. Indien meer of minder cellen voor ontdooiing kunnen de volumes van de DMSO oplossingen worden geschaald als nodig.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
