İzolasyon ve Neonatal Rat kardiyomiyositlerde Kryoprezervasyon
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
Kardiyomiyositlerin Hücre kültürü, modern kardiyak araştırma kritik bir araçtır. Yenidoğan sıçan kardiyomiyositler (NRCMs) yaygın izolasyon beri kullanılan ve kültür yetişkin sıçan kardiyomiyositlerde 1 daha kolaydır. NRCM yöntemi hala çanak, uzun izolasyon prosedürü ve sınırlı hücre çoğalması dahil olmak üzere, çeşitli sınırlamalar vardır. En genel iş 2-6 4-48 saat gerektiren NRCMs izolasyonu için çok sayıda protokoller vardır. Buna ek olarak, hücreler sıklıkla 2 günlük sıçan yavrularından 2,4-7 1'den izole edilir; Doğum zamanlaması laboratuarında diğer çalışmaları ile öngörülemeyen ve çatışma olabilir. hücrelerin sadece küçük bir miktar deneyler için gerekli olup olmadığını izolasyon israf olduğu olabilir. Izolasyon süresini azaltarak iş akışı odak iyileştirilmesi çoğu çabaları, henüz bu yavruların doğum zamanlama sorunları çözmez.
Alternatif olarak, birçok laboratuvar kullanmakEmbriyonik kök hücreler (EKH) ya da uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) türetilen kardiyomiyositlerde. Ancak, yeniden programlama ve / veya farklılaşma süreci çok zaman alıcı ve masraflı de olabilir. In vitro olarak, miyosit model olarak, bu hücreler kullanılarak başka problemler de olabilir. Hem Esc ve iPSC- türetilmiş kardiyomiyositlerde birincil kardiyomiyositlerde 8-10 elektrofizyoloji farklılıkları sergiledikleri gösterilmiştir.
Disosiye NRCMs soğutma 11 kullanılarak birkaç gün depolanan yeteneğine sahip, henüz bu uzun süreli depolama için izin vermez. Sıvı azot tipik olarak belli bir süre ile hücreleri korumak için kullanılır, ancak dimetil sülfoksit (DMSO) gibi bir dondurarak saklama koruyucusu gibi gerektirir. Önceki araştırmalar dondurma medyada% 5-10 DMSO arasında ideal konsantrasyon NRCMs iyileştirilmesi için izin verdiğini göstermiştir, ancak o zaman bile canlılığı düşük 12 kalır. DMSO ücretsiz sırasında hücrelerin korunmasına yardımcı olur rağmenkuvvet, 1.5,% 13 üzerindeki konsantrasyonlarda hücreler için toksik olabilir. Daha önce yapılan çalışmalar yavaş hücrelerden DMSO kaldırma hücre canlılığı 14 iyileştirebileceğini göstermektedir.
Bu ayrılmasından sonra cryopreserving hücreleri tarafından NRCM hücre bazlı deneylerde verimliliğini artırmak için çalışmıştır. Bu hücreler çözülür ve gerektiğinde, izolasyonları ve hayvan tüketimi sıklığının azaltılması kullanılacak sağlar. Bu yöntemi kullanarak, bu NRCMs dondurularak saklanabilmesi ve daha sonraki bir zamanda kullanılmak üzere çözülme mümkün olduğunu göstermektedir. Çözülme sonra hücreler kabul edilebilir canlılığını korumak ve kendiliğinden α-aktinin sarkomerik (α-SA) ve sözleşme için pozitif NRCM kültürleri üretmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
NRCMs, izole dondurulan ve çözülmüş olması için bu protokol sağlar. Hücrelerin çözülmesi prosedürünün çok önemli bir kısmıdır. DMSO Bir dizi sıvı yavaşça hücreler 14 DMSO'yu çıkarmak için kullanılır. Bu DMSO çıkarma hücreleri çözüldükten sonra hemen ölen özellikle duyarlı hızlı bir şekilde yapılması önemlidir. Daha fazla veya daha az hücre eritme işlemi için gerekli olan, gerektiğinde, DMSO çözeltisi hacimleri ölçeklendirilebilir.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
