Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
Celgebaseerde proeven een belangrijk instrument voor de ontwikkeling en ontdekking van nieuwe geneesmiddelen tegen kanker. 1,2 Historisch monolayer kweken van kankercellen zijn gebruikt om de werkzaamheid van kandidaat verbindingen tegen specifieke soorten kankercellen te onderzoeken. De onderhoudsvriendelijkheid van monolaagkweken in standaard kweekplaten, de verenigbaarheid van standaard platen met commerciële robotachtige hulpmiddelen voor toevoeging van reagentia en Screening materieel downstream analyse van de cellulaire responsen op chemische verbindingen zijn belangrijke voordelen die 2D culturen render aantrekkelijk instrument voor drug testen. 3 Helaas monolaag cel assays vaak niet de werkzaamheid van de verbindingen in vivo te voorspellen, waardoor ontwikkeling en ontdekking van geneesmiddelen een uiterst kostbaar proces. 4,5 Ondanks aanzienlijke investeringen en inspanningen van farmaceutische bedrijven en academische eenheden slechts ~ 1% van anti-kanker medicijnen in klinische studies werden goedgekeurddoor de FDA in de afgelopen twee decennia. 6 ongelijkheid tussen 2D culturen en complexe 3D omgeving van kankercellen in vivo een belangrijke tekortkoming van monolaag kweeksystemen. 7 Daarom screenen van kandidaatverbindingen tegen tumorcellen in een omgeving die meer lijkt de 3D-tumor-omgeving kan de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor chemotherapie te versnellen. 8
Kankercel sferoïden vormen een relevante 3D tumormodel in vitro. 9,10 sferoïden zijn compacte clusters die door spontane of geïnduceerde samenstel van kankercellen op niet-klevende oppervlakken of in suspensie met technieken als spinner kolf, vloeibare bedekking, microfabricated micro- vormen . goed arrays, microfluidics en opknoping druppels 11-16 sferoïden bootsen hoofdkenmerken van solide tumoren zoals geometrie en beperkte transport van zuurstof, voedingsstoffen en geneesmiddelverbindingen in de centrale zone; vandaar, ze nauwer regenereren drug verantse van vaste tumoren ten opzichte van monolayer kweken. 17-19 Desondanks duidelijke voordeel, sferoïden worden niet routinematig gebruikt voor het screenen van chemische verbindingen tegen kankercellen. Moeilijkheid van het produceren van een uniforme en kleinbedrijf bolletjes in een standaard high throughput instelling die compatibel zijn met de handel verkrijgbare robotica en screening / imaging-tools is belemmert integratie van spheroïde cultuur in de ontwikkeling van geneesmiddelen pijplijn. Hoewel de aangepaste materialen en borden onlangs commercieel beschikbaar zijn geraakt aan deze behoefte te voorzien, kostenoverwegingen afschrikken hun wijdverbreide gebruik.
Twee belangrijke technieken met het vermogen van de productie consistente en kleinbedrijf sferoiden in high throughput gebruik maken van een nieuwe hangende druppel platform en microfabricated microputjes. 13,16,20 Echter, beide benaderingen vereisen speciale borden en apparaten die duur om te fabriceren en onhandig voor de eindgebruikers zijn in de kern van onderzoekscentra en de farmaceutische industrie, waar de meeste grote efforten voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen tegen kanker worden gemaakt. Ondanks enkele verbeteringen in de stabiliteit van-cel met druppels met een recente ontwerp van opknoping druppel platen, wordt slechts om de andere gat van de plaat nog steeds gebruikt tijdens de cultuur te verspreiden / samenvoegen van druppels te vermijden. 16 Dit vermindert aanzienlijk experimentele doorzet. Drugsverslaving en vernieuwing is moeilijk met manuele of gerobotiseerde pipetteren en spheroids moet in een standaard plaat voor biochemische analyse over te dragen, omdat deze plaat configuratie is niet gemakkelijk compatibel met conventionele screening apparatuur zoals plaat lezers. 21 Micro-putten vervaardigd met behulp van zachte lithografie ook toestaan gecontroleerde grootte spheroïde productie. 13,20 Echter, onverenigbaarheid van dit platform met standaard pipetteren gereedschap voorkomt het behandelen van individuele bolletjes met verschillende drug verbindingen / concentraties, het blootstellen van alle bolletjes op een enkele behandeling staat. Aldus is deze methode niet geschikt voor highthroughput screening verbinding die gelijktijdig testen van verschillende verbindingen / concentraties vereist.
Om deze obstakels te overwinnen, is een nieuwe techniek voor hoge doorvoer productie van gelijkvormige kankercel sferoïden in standaard 96-well platen ontwikkeld. 22,23 De aanpak is gebaseerd op een polymeer waterige tweefasensysteem (ATPS) en polyethyleen glycol ( PEG) en dextran (DEX) als fase-vormende polymeren. 24 ATPSs zijn onlangs gebruikt in een verscheidenheid van nieuwe celbiologische toepassingen cel micropatterning inschakelen en gelokaliseerde aflevering van biologische reagentia aan cellen in zeer waterige media. 25-32 een vorm sferoïde, zijn kankercellen gemengd met de waterige fase DEX en een sub-microliter daling van de resulterende suspensie wordt gepipetteerd in een putje met de onderdompeling waterige PEG-fase oplossing. De druppel blijft mengbare van de onderdompeling fase en beperkt cellen de vorming van een sferoïde vergemakkelijken. Kabouterortantly, de hoogst waterige onderdompeling fase levert voedingsstoffen naar de cellen van de bolvormige en minimaliseert het bekende probleem van media verdamping gemeen andere assays die veranderingen in media osmolaliteit en schommelingen geneesmiddelconcentraties veroorzaakt. Deze techniek maakt bolvormige productie en behandeling met geneesmiddelen alleen gebruikmaking van commercieel verkrijgbare reagentia en pipetteren gereedschappen in standaard 96-well platen. Belangrijk is de analyse van cellulaire reacties van sferoïden in hetzelfde plaat met standaard biochemische assays en plaatlezers. Het gemak van het werken met ATPS en het aanpassingsvermogen van de aanpak van de robot liquid handling maakt high throughput generatie van zowel mono-cultuur en de co-cultuur sferoiden een eenvoudige laboratoriumtechniek. Deze nieuwe aanpak zal een grote stap voorwaarts zijn in de richting van integratie van de kankercel sferoïden in ontwikkeling en ontdekking van geneesmiddelen processen met verbeterde testen doorvoer en kosteneffectiviteit (toename van het aantal geteste verbindingen en reduced reagensverbruik) en efficiëntie (het verminderen van hands-on tijd).
Een gedetailleerd protocol voor gerobotiseerde productie van kankercel sferoïden in 96-well platen met de ATPS methode wordt hieronder beschreven. Verder worden bijzonderheden van therapie van verkregen sferoïden en stroomafwaarts analyse van de cellulaire responsen met een commercieel biochemische assay gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sferoïden presenteren een realistisch model om beter te begrijpen tumor fysiologie en werkzaamheid van het geneesmiddel en een nuttig hulpmiddel voor anti-kanker drug discovery. Dergelijke toepassingen zouden veel baat hebben bij eenvoudige spheroïde generatie en onderhoud technieken die alleen standaard laboratorium, liquid handling gereedschappen en screening apparatuur vereisen. Het gebruik van een waterige tweefasensysteem spontaan aggregaat kankercellen in de onderstaande fase maakt een efficiënte productie en o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
References
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery–a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. . Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
