Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing
Summary
A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.
Abstract
Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.
Introduction
Tests auf Zellbasis ein wichtiges Instrument für die Entwicklung und Entdeckung neuer Antikrebsmittel. 1,2 Historisch Schichtkulturen von Krebszellen verwendet worden, um die Wirksamkeit von Testverbindungen gegen bestimmte Typen von Krebszellen zu untersuchen. Die Wartungsfreundlichkeit der Monolayer-Kulturen in Standardkulturplatten, die Kompatibilität der Standardplatten mit handelsüblichen Roboter-Tools für die Zugabe von Reagenzien und mit Screening-Geräte für nachgeschaltete Analyse der zellulären Reaktionen auf chemische Verbindungen sind die wichtigsten Vorteile, die 2D-Kulturen ein attraktives Werkzeug machen für Drogentests. 3 Leider Monolayer-Zellassays häufig nicht die Wirksamkeit der Verbindungen in vivo vorherzusagen, so dass der Arzneimittelentwicklung und Entdeckung eine sehr kostspieliges Verfahren. 4,5 Trotz erheblicher Investitionen und Anstrengungen von Pharmaunternehmen und akademischen Einheiten nur ~ 1% von Anti-Krebs-Medikamente in klinischen Studien genehmigtvon der FDA in den letzten zwei Jahrzehnten. 6 Ungleichheit zwischen 2D Kulturen und der komplexen 3D-Umgebung von Krebszellen in vivo ist ein Hauptnachteil der Monolayer-Kultur-Systeme. 7 daher Screening von Kandidatenverbindungen gegen Tumorzellen in einer Umgebung, die mehr ähnelt die 3D-Tumorumgebung kann die Entwicklung neuer Chemotherapeutika beschleunigen. 8
Krebszell Sphäroide ein den entsprechenden 3D Tumormodell in vitro. 9,10 Sphäroide kompakte Cluster, die durch spontane oder induzierte Anordnung von Krebszellen auf nicht-adhärenten Oberflächen oder in Suspension unter Verwendung von Techniken wie Rotationskolben, Flüssigkeitslagerung, mikrofabrizierten mikro bilden . auch Arrays, Mikrofluidik und hängenden Tropfen 11-16 Spheroids nachahmen Merkmale von soliden Tumoren wie Geometrie und begrenzte Transport von Sauerstoff, Nährstoffen und Wirkstoffen für Arzneimittel in der zentralen Zone; damit sie enger Medikament Verant regenerierense von soliden Tumoren im Vergleich zu Monolayer-Kulturen. 17-19 Trotz dieser deutlichen Vorteil, Sphäroiden nicht routinemäßig für das Screening von chemischen Verbindungen gegen Krebszellen eingesetzt. Schwierigkeit, einheitliche Größe Sphäroiden in einer Standard-Hochdurchsatz-Einstellung, die mit handelsüblichen Robotertechnik und Screening / Imaging-Tools kompatibel ist behindert Einbeziehung der Sphäroid-Kultur in die Entwicklungspipeline. Obwohl benutzerdefinierte Materialien und Platten wurden vor kurzem im Handel erhältlich sein, um diesem Bedarf zu begegnen, aus Kostengründen abschrecken ihren weit verbreiteten Einsatz.
Beide Ansätze erfordern zwei Haupttechniken mit der Fähigkeit zur Herstellung von konsistenten großen Sphäroide in hohem Durchsatz verwendet eine neue Hängetropfen Plattform und mikrofabrizierte Mikrovertiefungen. 13,16,20 jedoch spezielle Platten und Vorrichtungen, die in der Herstellung teuer und unbequem für den Endpoint sind in Kernforschungszentren und der pharmazeutischen Industrie, wo die meisten großen efForts für die Entdeckung von neuen Antikrebsmitteln vorgenommen. Trotz einiger Verbesserungen in der Stabilität der Zellen enthaltende Tropfen mit einem aktuellen Design der hängenden Tropfen Platten wird nur jedes zweite Loch der Platte noch während der Kultur verwendet werden, um die Verbreitung / Zusammenführen von Tropfen zu vermeiden. 16 Diese Versuchsdurchsatz deutlich abnimmt. Drogenabhängigkeit und der Erneuerung ist schwierig, mit manueller oder Roboter Pipettieren und Sphäroiden müssen in eine Standard-Platte für die biochemische Analyse übertragen werden, da diese Platte-Konfiguration ist nur schwer mit der herkömmlichen Screening-Geräte wie Plattenreadern. 21 Mikrobohrungen mittels Softlithographie auch hergestellt eine kontrollierte Größe Sphäroid Produktion. 13,20 Aber Unvereinbarkeit dieser Plattform mit Standard Pipettierwerkzeugen verhindert Behandlung einzelner Kügelchen mit verschiedenen Arzneimittelverbindungen / Konzentrationen, was allen Kügelchen nach einer einzigen Behandlung Zustand. Somit ist dieses Verfahren nicht für HochfallsDurchsatz Screening von Verbindungen, die eine gleichzeitige Prüfung mehrerer Verbindungen / Konzentration erfordert.
Um diese Hindernisse zu überwinden, wurde eine neue Technik für die Hochdurchsatzproduktion von gleichbleibend große Krebszelle Sphäroiden in Standard-96-Well-Platten entwickelt. 22,23 Der Ansatz basiert auf einem polymeren wässrigen Zweiphasensystem (ATPS) mit Polyethylenglykol (basierend PEG) und Dextran (DEX) als phasenbildende Polymere. 24 ATPS wurden kürzlich in einer Reihe von neuartigen zellbiologische Anwendungen Zelle Mikrostrukturierung erlauben 25-32 verwendet und die lokalisierte Verabreichung von biologischen Reagenzien auf Zellen, die in wässrigen Medien sehr worden. Um ein Formular Sphäroid, sind Krebszellen mit der wässrigen Phase DEX und Untermikroliter-Tropfen der erhaltenen Suspension gemischt wird in eine Vertiefung, die die Eintauchphase wässrige PEG-Lösung pipettiert. Der Tropfen bleibt mischbaren dem Eintauchphase und beschränkt Zellen zur Bildung eines Sphäroids erleichtern. Koboldortantly stellt die stark wässrigen Eintauchphase Nährstoffe zu den Zellen des Sphäroids und das bekannte Problem der Medien Verdampfen gemeinsam zu anderen Assays, die Veränderungen in der Medien Osmolalität und Schwankungen der Wirkstoffkonzentrationen verursacht minimiert. Diese Technik ermöglicht die Produktion Sphäroid und medikamentöse Behandlung nur mit im Handel erhältlichen Reagenzien und Pipettierwerkzeugen in Standard-96-Well-Platten. Wichtig ist, dass Analyse der zellulären Reaktionen von Sphäroiden in der gleichen Platte mit Standard-biochemische Tests und Plattenlesegeräte durchgeführt. Die Leichtigkeit der Arbeit mit ATPS und Anpassungsfähigkeit der Ansatz zur Roboter Liquid Handling ermöglicht Hochdurchsatz-Generation sowohl Monokultur und Co-Kultur Sphäroide eine einfache Labortechnik. Dieser neue Ansatz wird ein wichtiger Schritt in Richtung Integration der Krebszelle Sphäroiden in der Arzneimittelentwicklung und Discovery-Prozesse mit verbesserter Testdurchsatz und Wirtschaftlichkeit (zunehmende Zahl von getesteten Verbindungen und redu seinced Reagenzienverbrauch) und Effizienz (Verringerung der Hands-on-Zeit).
Ein detailliertes Protokoll für Roboter Herstellung von Krebszell Sphäroide in 96-Well-Platten unter Verwendung des ATPS Ansatz wird nachstehend beschrieben. Zusätzlich werden Details der medikamentösen Behandlung der resultierenden Kügelchen und nachgeschaltete Analyse der zellulären Reaktionen unter Verwendung eines kommerziellen biochemischen Test dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sphäroide ein realistisches Modell, besser zu verstehen Tumorphysiologie und Wirksamkeit von Medikamenten und bieten ein nützliches Werkzeug für Anti-Krebs-Medikamentenentwicklung. Solche Anwendungen würden in hohem Maße von einfachen Techniken Sphäroid Erstellung und Pflege, die nur Standardlaborgeräte, Liquid Handling-Tools und Siebanlagen benötigen profitieren. Die Verwendung eines wässrigen Zwei-Phasen-System spontan Aggregatkrebszellen innerhalb der Tropfenphase ermöglicht die effiziente Produktion und Wa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.
Materials
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, Mw: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, Mw: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Corning | 7007 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M |
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