Robotic Produktion af Cancer Cell Sfæroider med en vandig tofasesystem for Drug Testing

Summary

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Abstract

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Introduction

Cellebaserede analyser giver et vigtigt redskab til udvikling og opdagelse af nye lægemidler mod kræft. ^1,2 Historisk har enkeltlagskulturer af cancerceller været ansat til at undersøge effekten af kandidatforbindelser mod bestemte typer af cancerceller. Den lette vedligeholdelse af monolagskulturer i standard dyrkningsplader, kompatibiliteten af ​​standard plader med kommercielle robot værktøjer til tilsætning af reagenser, og med screening udstyr til downstream analyse af cellulære reaktioner på kemiske forbindelser er de store fordele, der gør 2D kulturer et attraktivt værktøj for test af lægemidler. ³ Desværre monolag celleassays ofte undlader at forudsige effekten af forbindelser in vivo, hvilket gør lægemiddeludvikling og opdagelse en yderst bekostelig proces. ^4,5 Trods betydelige investeringer og indsats af farmaceutiske virksomheder og akademiske enheder, kun ~ 1% af anti-cancer lægemidler i kliniske forsøg blev godkendtaf FDA i løbet af de seneste to årtier. ⁶ forskellen mellem 2D kulturer og komplekse 3D-miljø af cancerceller in vivo er en væsentlig mangel ved monolagskultur systemer. ⁷ derfor screening af kandidatforbindelser mod tumorceller i en indstilling, der mere ligner 3D tumor miljø kan fremskynde udvikling af nye kemoterapi narkotika. ⁸

Kræftcelle sfæroider fremlægge et relevant 3D tumor-model in vitro. ^9,10 Sfæroider er kompakte klynger, der danner gennem spontan eller induceret samling af kræftceller på ikke-klæbende overflader eller i suspension ved anvendelse af teknikker såsom spinnerkolbe, flydende overlay, mikrofabrikerede mikro- . godt arrays, mikrofluidik og hængende dråber ^11-16 Sfæroider efterligne centrale elementer i solide tumorer, herunder geometri og begrænset transport af ilt, næringsstoffer og lægemiddelforbindelser i den centrale zone; Derfor har de i højere grad regenerere narkotika ResponSE for solide tumorer sammenlignet med monolagskulturer. ^17-19 På trods af denne markante fordele, der spheroids ikke rutinemæssigt anvendes til screening af kemiske forbindelser mod kræftceller. Vanskeligheder med at producere ensartet størrelse spheroids i en standard high throughput indstilling, der er kompatibelt med kommercielt tilgængelige robotteknologi og screening / billeddiagnostiske værktøjer hæmmer inkorporering af klumpformet kultur i lægemiddeludvikling pipeline. Selvom brugerdefinerede materialer og plader nylig blevet kommercielt tilgængelige at imødekomme dette behov, omkostningsmæssige overvejelser afskrække deres udbredte anvendelse.

To store med evne til at producere konsistente mellemstore spheroids i high throughput bruge en ny hængende dråbe platform og mikrofabrikerede mikro-brønde. ^13,16,20 dog kræver særlige plader og enheder, der er dyre at fremstille og ubelejligt for endpoint brugere begge fremgangsmåder i centrale forskningscentre og farmaceutiske industri, hvor de fleste større efforter til opdagelsen af ​​nye lægemidler mod kræft er lavet. Trods visse forbedringer i stabiliteten af celle-holdige dråber med en nylig design af hængende drop plader, er det kun hver anden hul i pladen stadig anvendes under dyrkning for at undgå spredning / sammenlægning af dråber. ^16. Dette formindsker eksperimentelle gennemløb betydeligt. Narkotikamisbrug og fornyelse er svært med manuel eller robot pipettering og spheroids skal overføres til en standard plade til biokemisk analyse, fordi denne plade konfiguration er ikke umiddelbart kompatible med konventionelt screening udstyr såsom plade læsere. ²¹ Micro-brønde fremstillet ved hjælp af bløde litografi også tillade kontrolleret størrelse klumpformet produktion. ^13,20 Men uforenelighed denne platform med standard pipettering værktøjer forhindrer behandling af individuelle spheroids med forskellige lægemiddelforbindelser / koncentrationer, udsætter alle spheroids til en enkelt behandling tilstand. Således er denne fremgangsmåde ikke egnet til højthroughput forbindelse screening, der kræver samtidig test af flere forbindelser / koncentrationer.

For at overvinde disse forhindringer, har en ny teknik til high throughput produktion af konsekvent mellemstore kræft celle spheroids i standard plader med 96 brønde blevet udviklet. ^22,23 Den tilgang er baseret på en polymer vandig tofasesystem (ATPS) med polyethylenglycol ( PEG) og dextran (DEX) som fase-dannende polymerer. ²⁴ ATPSs er for nylig blevet anvendt i en række af hidtil ukendte cellebiologiske applikationer for at muliggøre celle micropatterning og lokal afgivelse af biologiske reagenser til celler i stærkt vandige medier. ^25-32 at danne en sfæroide er cancerceller blandet med den vandige DEX fase og en sub-mikroliter dråbe af den resulterende suspension pipetteres ned i en brønd indeholdende nedsænkning vandig PEG fase opløsning. Faldet er fortsat ikke blandbare fra fordybelse fase og begrænser celler til at lette dannelsen af ​​en sfæroide. Importantly den yderst vandige nedsænkning fase tilfører næringsstoffer til celler i sfæroid og minimerer velkendt problem medier fordampning fælles for nogle andre assays, som forårsager ændringer i medier osmolalitet og svingninger i stofkoncentrationer. Denne teknik muliggør sfæroid produktion og lægemiddelbehandling kun ved anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser og pipettering værktøjer i standard 96-brønds plader. Vigtigt er analyse af cellulære reaktioner sfæroider udføres i den samme plade ved anvendelse af standard biokemiske assays og pladelæsere. Den lette at arbejde med ATPS og tilpasningsevne tilgangen til robot væskehåndtering gør high throughput generation af både mono-kultur og co-kultur sfæroiderne en enkel laboratorieteknik. Denne nye fremgangsmåde vil være et stort skridt fremad mod integration af kræft celle spheroids i lægemiddeludvikling og Discovery processer med forbedret test gennemløb og omkostningseffektivitet (stigende antal testede forbindelser og Reduced reagensforbrug) og effektivitet (reduktion hands-on tid).

En detaljeret protokol for robot produktion af cancercellelinier sfæroider i 96-brønds plader ved anvendelse af ATPS fremgangsmåde er beskrevet nedenfor. Desuden er detaljerne i lægemiddelbehandling af resulterende sfæroider og nedstrøms analyse af cellulære responser under anvendelse af en kommerciel biokemisk assay fremlagt.

Protocol

1. Fremstilling af polymere Vandig tofasesystem (ATPS) 0,5 g polyethylenglycol (PEG) (MW: 35.000) afvejes og føje det til 9,5 ml komplet vækstmedium i en steril 15 ml konisk til fremstilling af 10 ml 5% (w / v) vandig PEG fase. Bemærk: Tilføjelse halvdelen af ​​mediet til koniske først efterfulgt af tilsætning af polymeren og derefter den resterende mængde medium minimerer adhæsion af polymeren til de koniske vægge og hjælper polymer opløses hurtigere. 0,128 g dextran (DEX) (MW…

Representative Results

Arbejdsstationen af robot væskehåndteringsudstyr er vist i figur 1. Den pipettering hoved og alle stationer, der anvendes i robot trykning af sfæroider i afsnit 4.6 er mærket. Billedet viser anvendelsen af ​​to forskellige stationer for tip kasser (et sæt tips til blanding og det andet sæt til opsugning / dispensering cellesuspension-vandig DEX fase blanding). Hele setup ligger i en standard biologisk sikkerhedsskab at opretholde sterilitet. Figur 2 viser en skematisk afbildni…

Discussion

Sfæroider fremlægge en realistisk model for bedre at forstå tumor fysiologi og medicin effekt og give et nyttigt værktøj for anti-cancer drug discovery. Sådanne ansøgninger vil få stor gavn af simple klumpformet generation og vedligeholdelse teknikker, som kun kræver standard laboratorieudstyr, håndtering af flydende værktøjer og screening udstyr. Anvendelsen af en vandig tofasesystem spontant samlede cancerceller i drop fase muliggør effektiv produktion og vedligeholdelse af sfæroider med robot væskehån…

Materials

Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, Mw: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, Mw: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
Glutamine	Life Technologies	35050-061
Antibiotic	Life Technologies	15240-062
Clacein AM	Life Technologies	C3100MP
Hoechst	Life Technologies	33342
Cisplatin	Spectrum Chemicals	15663-27-1
PrestoBlue	Life Technologies	A-13261
Pluronic F-108	Sigma Aldrich	542342
Disposable Tips (10 µl)	Fluotics	C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)	Fluotics	C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates	Corning	7007
Equipment
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M