Robotic Produksjon av Cancer Cell Spheroids med en vandig To-fase system for Drug Testing

Summary

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Abstract

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Introduction

Cellebaserte analyser gir et viktig verktøy for utvikling og oppdagelse av nye anti-kreft narkotika. ^1,2 Historisk monolagkulturer kreftceller har blitt ansatt for å undersøke effekten av kandidat forbindelser mot bestemte typer kreftceller. Enkelt vedlikehold av monolagkulturer i standard kulturplater, kompatibiliteten av standard plater med kommersielle robot verktøy for tillegg av reagenser, og med screening utstyr for genetisk analyse av cellulære responser på kjemiske forbindelser er de store fordelene som gjør 2D kulturer et attraktivt verktøy for narkotikatesting. ³ Dessverre, monolayer celleanalyser ofte ikke klarer å forutsi effekten av forbindelser i vivo, noe som gjør narkotika utvikling og oppdagelse en ekstremt kostbar prosess. ^4,5 tross for betydelige investeringer og innsats av farmasøytiske selskaper og akademiske enheter, bare ~ 1% av anti-kreft narkotika i kliniske studier ble godkjentav FDA i løpet av de siste to tiårene. ⁶ Misforhold mellom 2D- kulturer og komplekse 3D-miljø av kreftceller in vivo er en stor brist av enlagskultur systemer. ⁷ Derfor screening av kandidat forbindelser mot kreftceller i en innstilling som mer ligner 3D svulst miljøet kan fremskynde utviklingen av romanen kjemoterapi narkotika. ⁸

Cancercelleklumper presentere en relevant 3D-tumormodellen in vitro. ^9,10 Spheroids er kompakte klaser som dannes ved spontane eller induserte sammenstillingen av kreftceller på ikke-adherente flater eller i suspensjon ved hjelp av teknikker som spinnerkolbe, flytende overlegg, microfabricated mikro- . vel arrays, MicroFluidics, og hengende dråper ^11-16 Spheroids ligne sentrale trekk ved solide tumorer inkludert geometri og begrenset transport av oksygen, næringsstoffer og narkotika forbindelser inn i den sentrale sonen; dermed de nærmere regenerere narkotika ansvarsse av faste tumorer i forhold til monolagskulturer. ^{17 til 19} tross for dette betydelig fordel, er sfæroider ikke rutinemessig anvendt for screening av kjemiske forbindelser mot kreftceller. Vanskeligheten med å produsere ensartet store kuler i en standard høy gjennomstrømning innstilling som er kompatibel med kommersielt tilgjengelige robotikk og screening / avbildningsverktøy vanskeliggjør inkorporering av sfæroide kultur i legemiddelutvikling rørledningen. Selv tilpassede materialer og plater har nylig blitt kommersielt tilgjengelig for å løse dette behovet, kostnadsvurderinger avskrekke sin utbredt bruk.

To hovedteknikker med evnen til å produsere konsekvente dimensjonerte kuler i høy gjennomstrømning bruke en ny hengende dråpe plattform og microfabricated mikrobrønner. ^13,16,20 imidlertid begge metoder krever spesielle plater og enheter som er kostbare å fremstille og upraktisk for endepunkt brukere i kjerneforskningssentre og farmasøytisk industri hvor de fleste større effortene for oppdagelsen av nye legemidler mot kreft er gjort. Til tross for noen forbedringer i stabilitet av celleholdige dråper med en nyere design hengende slippe plater, er bare annenhver hull av platen fortsatt brukes under kultur for å unngå spredning / sammenslåing av dråper. ¹⁶ Dette reduserer eksperimentell gjennomstrømming betydelig. Drug tillegg og fornyelse er vanskelig med manuell eller robotisert pipettering og kuler må overføres til en standard plate for biokjemisk analyse fordi denne platen konfigurasjonen er ikke lett kompatibel med konvensjonelt screening utstyr som plate lesere. ²¹ Micro-brønner fabrikkert ved hjelp av myke litografi også tillate kontrollert størrelse spheroid produksjon. ^13,20 Men uforlikelighet av denne plattformen med standard pipettering verktøy hindrer behandling av individuelle kuler med ulike medikament forbindelser / konsentrasjoner, utsette alle kulene til en enkelt behandling tilstand. Således er denne fremgangsmåte ikke egnet for høygjennomstrømming sammensatte screening som krever samtidig testing av flere forbindelser / konsentrasjoner.

For å overvinne disse hindringer har en ny teknikk for høy gjennomstrømning produksjon av gående størrelse cancercelleklumper i standard 96-brønners plater blitt utviklet. ^22,23 Metoden er basert på et polymert vandig tofasesystem (ATPS) med polyetylenglykol ( PEG) og dekstran (DEX) som fasedannende polymerer. ²⁴ ATPSs har nylig blitt anvendt i en rekke nye celle biologiske applikasjoner for å aktivere celle micropatterning og lokalisert levering av biologiske reagenser til celler i svært vandige medier. ^25-32 for å danne en sfæroide, har kreftceller blandes med den vandige DEX fase og en sub-mikroliters dråpe av den resulterende suspensjonen blir pipettert inn i en brønn inneholdende nedsenking vandige PEG-fase løsning. Fallet er fortsatt ikke blandbart fra nedsenking fasen og rammen celler for å lette dannelsen av en spheroid. Importantly, gir den meget vandige fase nedsenking næringsstoffer til cellene i den sfæroide og minimaliserer den velkjente problemet med media fordampning felles for noen andre assays som forårsaker endringer i medie osmolalitet og svingninger av medikamentkonsentrasjoner. Denne teknikken gjør det mulig sfæroide produksjon og behandling bare ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser og pipettering verktøy i standard 96-brønners plater. Det blir foretatt analyse av cellulære responser av kuler utføres på samme plate ved hjelp av standard biokjemiske analyser og platelesere. Det er utrolig lett å jobbe med ATPS og tilpasningsevne av tilnærmingen til robotvæskehåndtering gjør høy gjennomstrømning generasjon av både mono-kultur og co-kultur kuler en grei laboratorieteknikk. Denne nye tilnærmingen vil være et stort skritt fremover mot integrasjon av kreft celleklumper til narkotika utvikling og utforskprosesser med forbedret testing gjennomstrømming og kostnadseffektivitet (økende antall testede forbindelser og reduced reagensforbruk) og effektivitet (redusere hands-on tid).

En detaljert protokoll for robot produksjon av cancercelleklumper i 96-brønners plater ved bruk av ATPS tilnærming er beskrevet nedenfor. I tillegg, blir detaljene for behandling av resulterende sfæroider og nedstrøms analyse av cellulære responser ved å bruke en kommersiell biokjemisk analyse presentert.

Protocol

1. Utarbeidelse av Polymer Vandig Two Phase System (ATPS) Vei opp 0,5 g polyetylenglykol (PEG) (MV: 35.000) og legge det til 9,5 ml komplett vekstmedium i et sterilt 15 ml konisk for å fremstille 10 ml 5% (w / v) vandig PEG fase. Merk: Legge halvparten av mediet til den koniske først, etterfulgt av tilsetning av polymeren og deretter den resterende mengde medium minimaliserer adhesjon av polymeren til de koniske vegger og hjelper polymeren oppløses raskere. Veie 0,128 g dekstran (DEX) (MV:…

Representative Results

Den arbeidsstasjon av robotvæskebehandleren, er vist i figur 1. Den pipettering hodet og alle stasjoner som brukes i robot trykking av sfæroider i avsnitt 4.6 blir merket. Bildet viser bruken av to forskjellige stasjoner for tippe bokser (ett sett av tips for blanding og det andre settet for å aspirere / dispensering av cellesuspensjonen-DEX vandige faseblanding). Hele oppsettet er plassert innenfor en standard biologisk trygghetskabinett for å opprettholde sterilitet. Figur 2 viser…

Discussion

Kuler presentere en realistisk modell for å bedre forstå svulst fysiologi og narkotika effekt og gi et nyttig verktøy for anti-kreft medisiner. Slike søknader vil ha stor nytte av enkle spheroid generasjon og vedlikeholdsteknikker som kun krever standard laboratorie-utstyr, væskehåndtering verktøy og screening utstyr. Anvendelsen av et vandig tofasesystem for å spontant aggregerte kreftceller i fallet fase tillater effektiv produksjon og vedlikehold av sfæroider med robotvæskebehandlere, og in situ-behandl…

Materials

Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, Mw: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, Mw: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
Glutamine	Life Technologies	35050-061
Antibiotic	Life Technologies	15240-062
Clacein AM	Life Technologies	C3100MP
Hoechst	Life Technologies	33342
Cisplatin	Spectrum Chemicals	15663-27-1
PrestoBlue	Life Technologies	A-13261
Pluronic F-108	Sigma Aldrich	542342
Disposable Tips (10 µl)	Fluotics	C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)	Fluotics	C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates	Corning	7007
Equipment
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M