Lesión quirúrgica del páncreas del ratón a través de la ligadura del conducto pancreático como un modelo para el endocrino y exocrino Reprogramación y proliferación

Summary

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Abstract

Expansión de las células beta pancreáticas in vivo o ex vivo, o la generación de las células beta por la diferenciación de una célula madre embrionaria o un adulto, puede proporcionar nuevas fuentes expandibles de las células beta para aliviar la escasez de donantes en el trasplante de islotes humanos como terapia para la diabetes. Aunque los avances recientes se han hecho hacia este objetivo, los mecanismos que regulan la expansión de las células beta y la diferenciación de una célula madre / progenitoras aún no se han caracterizado. Aquí, se describe un protocolo para un modelo de lesión en el páncreas de ratón adulto que puede funcionar como una herramienta para estudiar los mecanismos de la remodelación tisular y proliferación de las células beta y la diferenciación. Parcial ligadura del conducto (PDL) es una lesión inducida experimentalmente del páncreas roedor que implica la ligadura quirúrgica del conducto pancreático principal que resulta en una obstrucción del drenaje de los productos exocrinas fuera de la región de la cola del páncreas. El daño infligido induce atrofia acinar, infilt célula inmuneración y la remodelación tisular grave. Hemos informado anteriormente de la activación de Neurogenina (NGN) 3 que expresan las células progenitoras como endógenos y un aumento en la proliferación de las células beta después de PDL. Por lo tanto, PDL proporciona una base para estudiar señales implicadas en la dinámica de las células beta y las propiedades de un progenitor endocrino en páncreas adulto. Dado que, todavía sigue siendo en gran medida poco clara, que los factores y las vías contribuyen a la neogénesis de células beta y la proliferación en PDL, un protocolo estandarizado para PDL permitirá la comparación entre laboratorios.

Introduction

El aumento de la prevalencia de la diabetes, que afecta a más de 300 millones de personas en todo el mundo ^1,2 ha impulsado la búsqueda de nuevas fuentes de células beta productoras de insulina, tanto in vitro como in vivo, para reponer la masa de células beta deficiente. ³ Identificar clave mecanismos y factores que regulan la proliferación de células beta y beta neogénesis de células, es decir, la diferenciación de las células beta a partir de una célula o células progenitoras no beta, pueden proporcionar nuevas dianas para el desarrollo de terapias regenerativas en la diabetes.

En el páncreas de roedores en desarrollo, todos los tipos de células endocrinas diferenciar de una población transitoria de células progenitoras endocrino, que expresa el factor de transcripción Neurogenin3 (Ngn3) ^4,5. En el páncreas roedor adulto, en condiciones fisiológicas normales, la masa de células beta es se mantiene a un número óptimo para satisfacer las demandas metabólicas. Los cambios en el tamaño de las células beta,apoptosis y la replicación constituyen los principales mecanismos para la expansión de células beta y turn-over. ^6-8 Mientras que el potencial de las células beta a proliferar en condiciones fisiológicas normales es homogénea en toda la población, ⁹ su tasa de proliferación es baja y re-replicación está restringida por un período dinámico de quiescencia o período refractario ^6,7, influenciado por la edad y el metabolismo de la glucosa. ¹⁰ Dado que las células progenitoras endocrinas hasta ahora no han sido identificados en el páncreas adulto normal, se cree neogénesis de no contribuir al crecimiento normal de las células beta del adulto. ⁸

Por lo tanto, la identificación de una célula progenitora endocrino facultativa en el páncreas adulto que es expandible y capaz de producir nuevas células beta podría proporcionar una novela, posiblemente fuente ilimitada de las células beta.

Parcial ligadura del conducto (PDL) es un modelo de lesión de animal que ha sido descrito para inducir neogenesi célula betas en el páncreas adulto. ^11,12 En este modelo, el conducto pancreático principal drenaje de la cola del páncreas se une quirúrgicamente. La obstrucción resultante de drenaje exocrino induce importante remodelación del tejido, acompañado por la inflamación y atrofia acinar distal a la ligadura. ^12-14 Dentro de este entorno inflamatorio, re-expresión del marcador progenitor endocrino Ngn3 se induce y el volumen de las células beta aumenta de dos veces . Esta duplicación en beta resultados del volumen celular de la generación de nuevas células beta a partir de un Ngn3 expresan de tipo embrionario de células progenitoras endocrino y de la proliferación de las células beta pre-existentes y recién formados que son propensos a volver a la duplicación sin "período de inactividad". ^11,15

Neogénesis de células beta y replicación en modelos de lesión, tales como la pancreatectomía ^6,7,16-19 y la ablación selectiva de las células beta ²⁰ se han descrito ampliamente. Sin embargo, el resultado regenerativa en thesmodelos e está influenciada por la magnitud de los daños causados ​​y se asocia con una masa de células beta inicial disminuido ^21. PDL es un modelo quirúrgico en el que no se ve afectada la masa inicial de las células beta y la neogénesis de células beta y la proliferación se activan robusta. De hecho, en el páncreas de ratones que se sometieron a PDL, las células que expresan Ngn3 se identifican cerca del revestimiento epitelial del conducto. Estas células se pueden aislar a partir de los páncreas de ratones transgénicos ligados Ngn3-GFP usando células activadas por fluorescencia (FACS) y son capaces de diferenciarse hacia células beta funcionales siguiente en el injerto y la cultura ex vivo del páncreas de E12.5 Ngn3 ^{– / –} . ratones ¹¹ Del mismo modo, en Ngn3 ^CreERT;. ratones R26 ^YFP en el que las células que activan el gen Ngn3 están etiquetados de forma permanente después de la inyección tamoxifeno, las células derivadas de células beta Ngn3 etiquetas positivas se detectan después de PDL ¹⁵ Por otra parte, las células beta recién formadas diluir pre -existing células beta y preferentemente localizar en pequeños islotes en el que las células beta muestran un alto potencial de proliferación. ¹⁵ Ngn3 es importante para la expansión de las células beta después de PDL ya la disminución de la expresión Ngn3 usando específica de la diana de ARN corto horquilla disminuye significativamente la masa de células beta y la proliferación de las células beta después PDL. ¹¹ En particular, la fracción de células derivadas de células beta Ngn3 y la masa de células beta después de PDL depende críticamente del nivel de Ngn3 inducción ^15. Esto está de acuerdo con la observación de que el alto nivel de expresión Ngn3 es un paso fundamental para el compromiso endocrina del páncreas progenitores multipotentes durante el desarrollo de páncreas ²² Además, la ablación selectiva de células que expresan Ngn3 por la administración de la difteria-toxina para Ngn3 ^CreERT;. Ratones R26 ^IDTR resultados en el contenido de insulina disminuida y la proliferación de células beta reducido, especialmente en pequeños islotes. ¹⁵

<pclass = "jove_content"> Aunque la inducción de la expresión Ngn3 en células de los conductos después de PDL ha sido confirmado por muchos ^{11,15,16,23,24,} Ngn3 expresión en células de islotes ^24,25 y discrepancias en el resultado de PDL desafió nuestras observaciones iniciales del aumento de la masa de células beta ^26,27, aparición de Ngn3 expresando progenitores conducto derivado endocrinas ^24,26,28,29, y aumento de la proliferación de las células beta ²⁷ después de PDL. ³⁰

Estos resultados contradictorios podrían, al menos en parte, atribuirse a una combinación de factores, incluyendo variaciones en los puntos de tiempo post-quirúrgicas de análisis, el peso corporal, el sexo y la edad de los ratones, condiciones fisiológicas y ambientales postoperatorias y, lo más importante, diferencias en la técnica quirúrgica. ³⁰ En nuestras manos, la proliferación de células beta, contenido de insulina, el volumen de las células beta y el número de pequeños islotes se incrementan constantemente después de PDL. TambiénNgn3 ARNm aumenta constantemente, pero hay grandes diferencias en la expresión de ARNm Ngn3 entre PDL páncreas cola, para los que no tenemos explicación directa. La hipótesis de que el nivel de ARNm Ngn3 podría correlacionar con el grado de neogénesis de células beta a partir de células no beta ^15, pero esto requiere de mayor fundamentación. A pesar de que no elimina todas las variaciones experimentales, un método estandarizado para la realización de la cirugía PDL permite una mejor uniformidad en los resultados y abre nuevas vías en el estudio de la proliferación de células beta y neogénesis.

Protocol

Todas las manipulaciones siguen las directrices emitidas por el Convenio Europeo para la Protección de los animales vertebrados utilizados para experimentación y otros fines científicos (ETS 123 y y 2010/63 / UE). 1. Preparación del área de trabajo Proporcionar un área de preparación dedicado, un área quirúrgica y un área de recuperación. Llevar a cabo todo el procedimiento quirúrgico en una cabina de flujo laminar para reducir al mínimo los contaminantes am…

Representative Results

PDL induce atrofia acinar y la inflamación, pero no afecta el peso corporal y la glucemia En 8 semanas de edad BALB / c ratones, el conducto de drenaje de las enzimas exocrinas de la cola del páncreas se liga mientras que la cabeza del órgano, situado adyacente al estómago y el duodeno, no se ve afectado. Edad, sexo y machos BALB / c ratones con peso se someten a cirugía simulada recapitular todas las medidas de la cirugía parcial ligadura del conducto, a excepción de…

Discussion

In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.

Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…

Materials

Supplies for preparation area
Hibiscrub	Regent Medical	5601IE5F11	Chlorhexidin diglucon
Ketamin	Ceva	BE-V202526	anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin)	Bayer	BE-V041815	anesthesia
Duratears	Alcon	34335-8	ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area
Leica Operating microscope	Leica	10446320
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools (FST)	18000-45
autoclaved surgical instruments	Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad	Gaymar Industries, Inc.	TP702
Adhesive OP-towel	BARRIER	706500-07
OP-tape	BARRIER	381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile)	Lohmann&Rauscher International	35968
Mini Plasco 0,9% NaCl solution	B.BRAUN	3521680
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
4-0 polyglycol suture	Ethicon	SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic	ecuPhar	BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer	Integrated DNA technologies	Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer	Integrated DNA technologies	Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175)	Cell Signaling	5A1E
anti-mouse/rat Ki67 antibody	eBioscience	14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse)	Sigma	085K4889
anti-rat Cytokeratin 19	DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU	Dako	M0744
Hoechst	Sigma	33342